Restrictie-enzymenfuncties, werkingsmechanisme, typen en voorbeelden



de restrictie-enzymen het zijn endonucleasen die door bepaalde archaea en bacteriën worden gebruikt om de verspreiding van virussen erin te remmen of "beperken". Ze komen vooral veel voor in bacteriën en maken deel uit van hun afweersysteem tegen vreemd DNA dat bekend staat als het restrictie- / modificatiesysteem.

Deze enzymen katalyseren het knippen van dubbelstrengs DNA op specifieke plaatsen, reproduceerbaar en zonder het gebruik van extra energie. De meeste vereisen de aanwezigheid van cofactoren zoals magnesium of andere tweewaardige kationen, hoewel sommige ook ATP of S-adenosylmethionine vereisen.

Restrictie-endonucleasen werden ontdekt in 1978 door Daniel Nathans, Arber Werner en Hamilton Smith, die de Nobelprijs voor Geneeskunde ontvingen voor hun ontdekking. De naam is meestal afgeleid van het organisme waar ze voor de eerste keer worden waargenomen.

Dergelijke enzymen worden veel gebruikt bij de ontwikkeling van DNA-kloneringsmethoden en andere strategieën voor moleculaire biologie en genetische manipulatie. De kenmerken van herkenning van specifieke sequenties en het vermogen om sequenties dicht bij herkenningssites te knippen, maken ze tot krachtige hulpmiddelen bij genetische experimenten.

De fragmenten die worden gegenereerd door de restrictie-enzymen die op een bepaald DNA-molecuul hebben gehandeld, kunnen worden gebruikt om een ​​"kaart" van het oorspronkelijke molecuul opnieuw te creëren door informatie te gebruiken over de plaatsen waar het enzym het DNA sneed.

Sommige restrictie-enzymen kunnen dezelfde herkenningsplaats in het DNA hebben, maar ze snijden het niet noodzakelijk op dezelfde manier. Dus, er zijn enzymen die sneden maken die botte uiteinden nalaten en enzymen die snijden, waardoor er samenhangende uiteinden achterblijven, die verschillende toepassingen hebben in de moleculaire biologie.

Momenteel zijn er honderden verschillende in de handel verkrijgbare restrictie-enzymen, aangeboden door verschillende commerciële huizen; deze enzymen werken als "aangepaste" moleculaire scharen voor verschillende doeleinden.

index

  • 1 Functies
  • 2 Werkingsmechanisme
  • 3 soorten
    • 3.1 Type I restrictie-enzymen
    • 3.2 Type II-restrictie-enzymen
    • 3.3 Type III restrictie-enzymen
    • 3.4 Type IV restrictie-enzymen
    • 3.5 Type V restrictie-enzymen
  • 4 voorbeelden
  • 5 Referenties

functies

Restrictie-enzymen dienen de tegenovergestelde functie van polymerasen, omdat ze de esterbinding in de fosfodiesterbinding tussen aangrenzende nucleotiden in een nucleotideketen hydrolyseren of verbreken.

In moleculaire biologie en genetische manipulatie zijn het veel gebruikte hulpmiddelen voor de constructie van expressie- en kloneringsvectoren, alsook voor de identificatie van specifieke sequenties. Ze zijn ook nuttig voor de constructie van recombinante genomen en hebben een groot biotechnologisch potentieel.

Recente ontwikkelingen in gentherapie maken huidig ​​gebruik van restrictie-enzymen voor de introductie van bepaalde genen in vectoren die vehikels zijn voor het transport van dergelijke genen naar levende cellen, en die waarschijnlijk het vermogen hebben om in het celgenoom te worden opgenomen om te presteren permanente veranderingen.

Werkingsmechanisme

Restrictie-enzymen kunnen het knippen van dubbelstrengig DNA katalyseren, hoewel sommige in staat zijn enkelstrengige DNA-sequenties en zelfs RNA te herkennen. De snede vindt plaats na de herkenning van de sequenties.

Het werkingsmechanisme bestaat uit de hydrolyse van de fosfodiesterbinding tussen een fosfaatgroep en een deoxyribose in de ruggengraat van elke DNA-streng. Veel van de enzymen kunnen op dezelfde plaats snijden die ze herkennen, terwijl anderen tussen 5 en 9 paar bases ervoor of erna snijden..

Normaal snijden deze enzymen aan het 5'-uiteinde van de fosfaatgroep, waardoor DNA-fragmenten ontstaan ​​met een 5'-fosforyl-uiteinde en een eindstandig 3'-hydroxyleind..

Omdat de eiwitten niet in direct contact komen met de herkenningsplaats in het DNA, moeten ze achtereenvolgens worden getransloceerd totdat ze de specifieke plaats bereiken, misschien door middel van "glijdende" mechanismen op de DNA-streng..

Tijdens de enzymatische snede wordt de fosfodiesterbinding van elk van de strengen DNA gepositioneerd binnen een van de actieve plaatsen van de restrictie-enzymen. Wanneer het enzym de herkennings- en snijplaats verlaat, doet het dit via niet-specifieke tijdelijke associaties.

type

Momenteel zijn vijf soorten restrictie-enzymen bekend. Hieronder een korte beschrijving van elk:

Type I restrictie-enzymen

Deze enzymen zijn grote pentamere eiwitten met drie subeenheden, een restrictie, een methylatie en een andere voor de herkenning van sequenties in DNA. Deze endonucleasen zijn multifunctionele eiwitten die in staat zijn om restrictie- en modificatiereacties te katalyseren, ze hebben ATPase-activiteit en ook DNA-topoisomerase.

Enzymen van dit type waren de eerste endonucleasen die ontdekt moesten worden, ze werden voor de eerste keer gezuiverd in de jaren zestig en sindsdien zijn ze met grote diepte bestudeerd.

Type I enzymen worden niet veel gebruikt als een biotechnologisch hulpmiddel, omdat de snijplaats zich op een variabele afstand van maximaal 1000 baseparen van de herkenningsplaats kan bevinden, wat ze onbetrouwbaar maakt in termen van experimentele reproduceerbaarheid.

Type II restrictie-enzymen

Het zijn enzymen die zijn samengesteld uit homodimeren of tetrameren die DNA knippen op gedefinieerde locaties met een lengte van 4 tot 8 bp. Deze knipplaatsen zijn typisch palindroom, dat wil zeggen dat ze reeksen herkennen die op dezelfde manier in beide richtingen worden gelezen.

Veel van de restrictie-enzymen van type II in bacteriën snijden DNA wanneer ze hun vreemde karakter herkennen, omdat ze niet de typische modificaties bezitten die het eigen DNA zou moeten hebben..

Dit zijn de eenvoudigste restrictie-enzymen omdat ze geen andere cofactor nodig hebben dan magnesium (Mg +) om de DNA-sequenties te herkennen en te knippen.

De nauwkeurigheid van restrictie-enzymen van type II bij het herkennen en knippen van eenvoudige sequenties in DNA op precieze posities maakt ze een van de meest gebruikte en onmisbare in de meeste takken van de moleculaire biologie.

Binnen de groep van type II restrictie-enzymen zijn meerdere subklassen geclassificeerd volgens bepaalde eigenschappen die uniek zijn voor elke subklasse. De classificatie van deze enzymen wordt gedaan door letters van het alfabet toe te voegen, van A tot Z na de naam van het enzym.

Sommige van de subklassen die het meest bekend staan ​​om hun bruikbaarheid zijn:

Subklasse IIA

Het zijn dimeren van verschillende subeenheden. Ze herkennen asymmetrische sequenties en worden gebruikt als ideale voorlopers voor het genereren van snij-enzymen.

Subklasse IIB

Ze zijn samengesteld uit nog een dimeer en knippen het DNA aan beide zijden van de herkenningssequentie. Ze knippen beide DNA-strengen in een reeks basenparen voorbij de herkenningsplaats.

Subklasse IIC

Enzymen van dit type zijn polypeptiden met functies van deling en modificatie van DNA-strengen. Deze enzymen snijden beide strengen asymmetrisch.

Subklasse IIE

De enzymen van deze subklasse zijn het meest gebruikt in genetische manipulatie. Ze hebben een katalytische site en vereisen in het algemeen een allosterische effector. Deze enzymen moeten twee kopieën van hun herkenningssequentie gebruiken om een ​​efficiënte snede te maken. In deze subklasse bevinden zich de enzymen EcoRII en EcoRI.

Type III restrictie-enzymen

Type III restrictie-endonucleasen zijn samengesteld uit slechts twee subeenheden, één is verantwoordelijk voor DNA-herkenning en -modificatie, terwijl de andere verantwoordelijk is voor het knippen van de sequentie.

Deze enzymen hebben twee co-factoren nodig voor hun functioneren: ATP en magnesium. Restrictie-enzymen van dit type bezitten twee asymmetrische herkenningsplaatsen, transloceren het DNA op een ATP-afhankelijke wijze en knippen het tussen 20 tot 30 bp grenzend aan de herkenningsplaats..

Type IV restrictie-enzymen

Type IV-enzymen zijn gemakkelijk te identificeren omdat ze DNA knippen met methyleringslabels, ze zijn opgebouwd uit verschillende subeenheden die verantwoordelijk zijn voor het herkennen en knippen van de DNA-sequentie. Deze enzymen gebruiken als co-factoren GTP en tweewaardig magnesium.

Specifieke knipplaatsen omvatten nucleotidenketens met residuen van gemethyleerd of gehydroxymethyleerd cytosine in één of beide strengen nucleïnezuren.

Type V restrictie-enzymen

Deze classificatie groepeert de CRISPER-Cas-type enzymen, die specifieke DNA-sequenties van binnenvallende organismen identificeren en knippen. Cas-enzymen gebruiken een streng van CRISPER gesynthetiseerd geleidings-RNA om binnenvallende organismen te herkennen en aan te vallen.

Enzymen geclassificeerd als type V zijn polypeptiden gestructureerd door type I, II en II enzymen. Ze kunnen delen van het DNA van bijna elk organisme en met een groot bereik van lengte knippen. Door hun flexibiliteit en gebruiksgemak zijn deze enzymen tegenwoordig een van de meest gebruikte hulpmiddelen in genetische manipulatie samen met type II-enzymen.

Voorbeelden

Restrictie-enzymen zijn gebruikt voor de detectie van DNA-polymorfismen, in het bijzonder in studies van populatiegenetica en evolutionaire studies met behulp van mitochondriaal DNA, om informatie te verkrijgen over de snelheden van nucleotidesubstituties..

Op dit moment hebben de vectoren die worden gebruikt voor de transformatie van bacteriën met verschillende doelen multiclonache-plaatsen waar herkenningsplaatsen voor meerdere restrictie-enzymen worden gevonden..

Onder deze enzymen zijn EcoRI, II, III, IV en V de meest populaire enzymen die voor het eerst zijn verkregen en beschreven E. coli; HindIII, uit H. influenzae en BamHI's B. amyloliquefaciens.

referenties

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D.H. (1993). Biologie van DNA-beperking. Microbiologische beoordelingen, 57(2), 434 - 450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., & Horvath, P. (2007). CRISPR biedt verwerving van resistentie tegen virussen in prokaryoten. wetenschap, 315(Maart), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Het moleculaire perspectief: restrictie endonucleasen. Stamcellen Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Hoppen, springen en lussen door restrictie-enzymen. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Behoud van soortidentiteit en beheersingsspeciatie van bacteriën: een nieuwe functie voor restrictie / modificatiesystemen? gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewin's Genes XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Gebruik van Type I en Type III CRISPR-Cas-systemen voor genome editing. Nucleic Acids Research, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T. F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Type I restrictie-enzymen en hun verwanten. Nucleic Acids Research, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restrictie Endonucleasen bij de analyse en herstructurering van DNA-moleculen. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). DNA-polymorfisme detecteerbaar door restrictie-endonucleasen. genetica, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellulaire en moleculaire levenswetenschappen Type II restrictie-endonucleasen: structuur en mechanisme. CMLS Cellulaire en moleculaire levenswetenschappen, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Hoe restrictie-enzymen de werkpaarden werden van de moleculaire biologie. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J., & Murray, K. (1976). Restrictie-endonucleasen. Kritieke beoordelingen in de biochemie, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B.L. (2005). Homing endonuclease structuur en functie. Kwartaalbeoordelingen van biofysica, 1-47.
  15.  Tock, M.R., & Dryden, D.T. F. (2005). De biologie van restrictie en anti-restrictie. Huidige mening in de microbiologie, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., & Murray, N.E. (1991). Beperkings- en wijzigingssystemen. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomisch inzicht in Campylobacter jejuni virulentie en populatiegenetica. Infecteren. Dis. Vert. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Structuur en mechanisme van multifunctionele restrictie-endonucleasen. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.