Bacteriële uitstrijkkarakteristieken en voorbereiding

de bacteriële uitstrijk is een uitbreiding in de vorm van een dunne film van een suspensie van bacteriële micro-organismen die wordt uitgevoerd op een transparante glasplaat of glasplaatjes, voor observatie onder een optische microscoop.

De uitbreiding in de vorm van film wordt uitgevoerd om de micro-organismen zo veel mogelijk te scheiden, want als ze gegroepeerd zijn, is de waarneming niet duidelijk.

In de studie van bacteriële kweken worden technieken van uitstrijkpreparatie, fixatie en kleuring gebruikt om ze beter te analyseren. Vanwege de kleine omvang van de micro-organismen, is het gebruik van een optische microscoop noodzakelijkerwijs nodig voor zijn waarneming.

De optische microscopen zijn onmisbare instrumenten voor het waarnemen van de uitstrijkjes. Deze maken gebruik van optische lenzen en licht waardoor de visualisatie van de monsters met grote toename in grootte.

In het algemeen hebben levende cellen geen structuren die meestal gekleurd zijn, gezien door de optische microscoop zijn ze kleurloze, transparante monsters en vertonen ze zeer weinig intern contrast en met hun omgeving.

Observatielicht helderveld microscopie eenvoudig, zonder gebruik van extra kleurtechnieken zeer beperkt en wordt alleen in sommige gevallen, zoals bij het observeren van de beweging van microorganismen.

Om micro-organismen optimaal te kunnen waarnemen, moet een balans tussen contrast en resolutie worden bereikt. De details van de cellen kunnen niet onder een microscoop worden waargenomen, zelfs niet bij een hoge resolutie; het gebruik van kleurstoffen is vereist door middel van kleurtechnieken, die contrast bieden voor observatie.

index

• 1 Kenmerken van een bacteriële uitstrijk van goede kwaliteit
  • 1.1 Uitstekend contrast
  • 1.2 Goede oplossing
  • 1.3 Goede kleuring
• 2 Voorbereiding
  • 2.1 A. Frotis
  • 2.2 B. Fixatie
  • 2.3 C. Eenvoudige kleuring
  • 2.4 D. Definitieve conservering van het uitstrijkje
• 3 referenties

Kenmerken van een bacteriële uitstrijk van goede kwaliteit

Uitstekend contrast

Om een ​​uitstekend contrast te bereiken, worden er geraffineerde microscopen genoemd fasecontrastmicroscoop, differentiële interferentie en donkerveldmicroscoop. Dit type microscoop wordt gebruikt voor het waarnemen van bacteriële structuren zoals omhulsels en filamenten, onder andere.

Kleuring is een eenvoudige techniek om het contrast te vergroten dat wordt bereikt met een veldmicroscoop. In deze techniek kunnen verschillende kleurstoffen worden gebruikt die de waarneming onder de microscoop merkbaar verbeteren.

De vlekken worden rechtstreeks aangebracht op de uitstrijkjes of verlengingen van de suspensies van micro-organismen op de glaasjes, eerder gedroogd en gefixeerd.

Goede oplossing

Fixatie is een techniek die wordt gebruikt om cellulaire structuren te behouden; veroorzaakt inactivatie van de micro-organismen en hechting aan het glas van de glijbaan. Er zijn verschillende fixatiebehandelingen: warmtebevestiging en chemische fixatie.

Warmtebevestiging

Dit is de methode die het meest wordt gebruikt bij het waarnemen van bacteriële uitstrijkjes. De techniek bestaat uit het doorgeven van de bacteriële suspensie van het uitstrijkje door de vlam van een aansteker. Deze techniek is in staat om de externe morfologie van bacteriën te behouden, maar vernietigt hun interne structuren.

Chemische fixatie

Chemische fixatie maakt gebruik van chemicaliën in conservering, zoals formaldehyde of formaldehyde, ethanol en azijnzuur. Het voordeel van het gebruik van chemische fixatiemiddelen is dat het behoud van de interne cellulaire structuren van de micro-organismen wordt bereikt.

Goede kleuring

De meest gebruikelijke procedures voor het kleuren van een eerder gedroogd en gefixeerd uitstrijkje zijn positieve of eenvoudige kleuring, differentiële kleuring en negatieve kleuring. Er zijn ook speciale technieken voor het kleuren van bepaalde celstructuren (capsule, sporen, flagella).

Positieve kleuring of eenvoudige kleuring

Positieve of eenvoudige kleuring is de meest gebruikte vlekuitstrijktechniek. Gebruikt kleurstoffen die het vermogen hebben om te binden aan bepaalde microbiële structuren, waardoor ze onder een microscoop kunnen worden waargenomen.

Deze kleurstoffen hebben chromofore groepen (gekleurd gedeelte) in hun chemische structuur, met alternerende dubbele bindingen en eenvoudige bindingen (conjugatie). Deze bindingen kunnen op hun beurt ionische of covalente bindingen met enkele cellulaire structuren tot stand brengen.

De kleurstoffen die worden gebruikt bij positieve of eenvoudige kleuring zijn meestal chemische derivaten van de aniline (gekleurde organische zouten).

Aan de andere kant, onder de kleurstoffen kunnen we sommige vinden met een basische pH en andere met een zure pH.

Basiskleurstoffen

In basische kleurstoffen heeft de chromofoorgroep een positieve elektrische lading. De overgrote meerderheid van de prokaryotische micro-organismen hebben een neutrale interne pH en hun celoppervlak is negatief geladen. Door deze elektrostatische interactie bindt de chromofoor aan de cel en kleurt deze.

Voorbeelden van basische kleurstoffen zijn methyleenblauw, violetkristal, malachietgroen, basisch fuscine, safranine, onder andere.

Zure kleurstoffen

In zure kleurstoffen heeft de chromofoorgroep een negatieve elektrische lading. Deze worden gebruikt voor het kleuren van eiwitten met positief geladen aminogroepen. Voorbeelden van zure kleurstoffen zijn zuurfuscine, Bengaalse roos, Congo rood en eosine.

Differentiële kleuring

De techniek van differentiële kleuring bestaat uit het aanbrengen van twee kleurstoffen van verschillende kleur of intensiteit, om verschillende micro-organismen onder de microscoop te onderscheiden. Gramkleuring en zuur-alcohol resistentiekleuring zijn de meest gebruikte differentiële vlekken in de bacteriologie.

Gram-kleuring wordt gebruikt als een voorafgaande test om de vorm, grootte, celgroepering, naast het type celwand te kennen. Door de Gram-vlektest worden bacteriën met celwand geclassificeerd als Gram-positieve bacteriën en Gram-negatieve bacteriën.

Negatieve kleuring

Bij deze techniek worden chemische kleurstoffen gebruikt die niet doordringen tot het cellulaire inwendige, maar zij doen dat het medium waarin de micro-organismen verschijnen als een zwarte achtergrond.

In de negatieve kleuring techniek wordt de uitstrijkjes bereid met een druppel inkt of suspensie nigrosine, nadat men drogen bij kamertemperatuur tot een ondoorzichtige film doorgang van licht te vormen. Op deze manier worden de micro-organismen waargenomen als heldere vormen op een donkere achtergrond.

voorbereiding

A. Smeer

1.- Was de dia's heel goed, droog ze met absorberend papier en label ze in. Het label moet de inhoud van het preparaat, de datum en de naam van de persoon die het heeft verwerkt, vermelden.

2.- Steek de aansteker aan en steriliseer de inentingslus in de vlam tot deze roodgloeiend is.

3.- Laat het handvat afkoelen.

4.- Neem de buis van de bacteriecultuur, verwijder de dop en loop snel de opening van de buis in de buurt van de vlam van de aansteker (vlam).

5.- Introduceer de inentingslus in de buis met de bacteriecultuur en neem het monster.

6.- Als de kweek in vloeibaar medium is, plaats het genomen monster met de handgreep in het midden van de schuif en spreid het voorzichtig in een cirkel van ongeveer 2 cm in diameter.

7.- Reinig de inentingslus opnieuw.

8.- Laat het uitstrijkje in de lucht drogen.

9.- Herhaal stap 3 tot 8 drie keer.

10.- Als de kweek in een vast medium zit, moet eerder een druppel gedestilleerd water op de glijbaan worden gelegd. Dit wordt gedaan om een ​​klein monster van de cultuur genomen met de inoculatiehendel te mengen, volgens de indicaties van stappen 2 tot 5 (condities van asepsis).

11.- Verleng het verdunde monster met de waterdruppel op de schuif en herhaal drie keer.

B. Fixatie

1.- Voeg toe aan de droge uitstrijkjes-geproduceerd uit culturen in vloeibaar medium-, twee druppels methanol of absolute ethanol.

2.- Laat het drogen in de lucht weg van de aansteker.

3. Indien het uitstrijkje afkomstig uit een vast kweekmedium, wordt het gefixeerde uitstrijkjes droge hitte bewerkstelligd door het leiden van 2-3 maal sneller door de heetste zone van de brandervlam.

4.- Raak het onderste deel van het uitstrijkje aan met het dorsale deel van de linkerhand (voor rechtshandig, anders rechterhand gebruiken) en controleer of het koud is.

C. Eenvoudige kleuring

1.- Voeg 2 druppels van de geselecteerde kleurstof toe aan het uitstrijkje en laat het werken gedurende de tijd die nodig is in de specifieke protocollen van elke kleurstof (meestal tussen 1 en 5 minuten).

2. Sommige kleurstoffen vereisen gebruik van warmte voor activering, in welk geval er heel voorzichtig zijn bij het verhitten van de slede in de brandervlam (hanteren met een pincet om koken te voorkomen). Oververhitting van het uitstrijkje kan de cellen vernietigen die u wilt observeren.

3.- Verwijder overtollige verf door te wassen met gedestilleerd water uit een picette. Verwijder het waswater door zacht op de schuif op de rand te tikken, gekanteld op de werktafel.

4.- Laat lucht drogen.

5.- Afhankelijk van het type waarneming, wordt in deze fase een dekglaasje gebruikt of niet. Het dekglaasje beschermt en beschermt het uitstrijkje. Als in dit stadium een ​​waarneming wordt gedaan door onderdompeling in olie, wordt er geen dekglaasje gebruikt maar kan het uitstrijkje niet worden bewaard.

D. Definitieve conservering van het uitstrijkje

1.- Dompel het uitstrijkje opeenvolgend onder in elk van de hieronder aangegeven oplossingen, gedurende minimaal 5 minuten. Het doel van deze "baden" is om het uitstrijkje volledig uitgedroogd te laten. Elk reagens moet worden afgetapt voordat het uitstrijkje in het volgende bad wordt geïntroduceerd.

De volgorde van de dehydraterende baden is als volgt:

1. Ethanol 70%
2. 95% ethanol
3. Zuivere aceton
4. Meng aceton-xylol 1: 1
5. xyleen

Laat vervolgens aan de lucht drogen.

2.- Monteer het dekglaasje, bij voorkeur 22 × 22 mm, met Canadese balsem of een ander montagemiddel.

referenties

1. Briggs, G. (1965). Causale factoren bij microbiologische laboratoriumongevallen en -infecties. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
2. Cappucino, J.G. en Welch, C.T. (2017). Microbiologie: een laboratoriumhandboek. Pearson.
3. Holt, J.G. Editor. (1977). Het kortere Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8^th Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, T.R. en zaak; CL (2018). Laboratoriumexperimenten in de microbiologie. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostische Microbiologie. 14^th St. Louis, VS: Elsiever, Inc.