DNA-microarrays in wat het bestaat, procedure en toepassingen



een DNA-microarray, Dit wordt ook wel DNA-chip of DNA-microarray genoemd en bestaat uit een reeks DNA-fragmenten die zijn verankerd aan een fysieke ondersteuning van variabel materiaal, plastic of glas. Elk stuk DNA vertegenwoordigt een sequentie die complementair is aan een specifiek gen.

Het hoofddoel van microarrays is de vergelijkende studie van de expressie van bepaalde genen van belang. Het is bijvoorbeeld gebruikelijk dat deze techniek wordt toegepast op twee monsters - één onder gezonde omstandigheden en één pathologische - om te identificeren welke genen tot expressie worden gebracht en die niet in het monster zijn dat de aandoening weergeeft. Genoemd monster kan een cel of een weefsel zijn.

Over het algemeen kan de expressie van de genen worden gedetecteerd en gekwantificeerd dankzij het gebruik van fluorescerende moleculen. De manipulatie van de chips wordt in de meeste gevallen door een robot uitgevoerd en een groot aantal genen kan tegelijkertijd worden geanalyseerd.

Deze innovatieve technologie is nuttig voor een breed scala aan disciplines, van medische diagnostiek tot diverse moleculaire biologie studies op het gebied van proteomics en genomics.

index

  • 1 Waar bestaat het uit??
    • 1.1 Typen microarray
  • 2 Procedure
    • 2.1 RNA-isolatie
    • 2.2 Productie en labeling van cDNA
    • 2.3 Hybridisatie
    • 2.4 Systeemuitlezing
  • 3 toepassingen
    • 3.1 Kanker
    • 3.2 Andere ziekten
  • 4 Referenties

Waar bestaat het uit??

DNA-microarrays (deoxyribonucleïnezuur) zijn een reeks specifieke DNA-segmenten die aan een vaste matrix zijn bevestigd. Deze sequenties zijn complementair aan de genen die bestudeerd willen worden en er kunnen tot 10.000 genen per cm zijn2.

Deze kenmerken laten de systematische en massieve studie toe van de genexpressie van een organisme.

De informatie die een cel nodig heeft voor zijn werking is gecodeerd in eenheden die "genen" worden genoemd. Bepaalde genen bevatten instructies voor de aanmaak van essentiële biologische moleculen die eiwitten worden genoemd.

Een gen wordt tot expressie gebracht als het DNA wordt getranscribeerd naar een intermediaire molecule van boodschapper-RNA en de expressie van het gen kan variëren afhankelijk van het niveau van transcriptie van dit segment van DNA. In bepaalde gevallen kan de verandering in expressie wijzen op ziektes.

Het principe van hybridisatie maakt de werking van de microarrays mogelijk. DNA is een molecuul dat bestaat uit vier soorten nucleotiden: adenine, thymine, guanine en cytosine.

Om de dubbele helixstructuur te vormen, is adenine gegroepeerd met thymine en cytosine met guanine. Aldus kunnen twee complementaire ketens worden gekoppeld door waterstofbruggen.

Typen microarrays

Wat betreft de structuur van microarrays zijn er twee varianten: de op maat gemaakte complementair DNA of oligonucleotide microarrays en commerciële hoge dichtheid door commerciële bedrijven zoals Affymetrix GeneChip.

Het eerste type maakt de microarray-analyse van RNA van twee verschillende monsters in een enkele chip, terwijl de tweede variatie van het commerciële type en heeft een groot aantal genen (bijvoorbeeld Affymetrix GeneChip heeft ongeveer 12.000 menselijke genen) mogelijk analyses een enkel monster.

procédé

RNA-isolatie

De eerste stap om een ​​experiment uit te voeren met behulp van microarray-technologie is de isolatie en zuivering van RNA-moleculen (kan messenger RNA of andere soorten RNA zijn).

Als u twee monsters wilt vergelijken (gezond versus ziek, controle versus behandeling, onder andere), moet de isolatie van het molecuul in beide weefsels worden gedaan.

Productie en labeling van cDNA

Vervolgens wordt het RNA onderworpen aan een proces van omgekeerde transcriptie in de aanwezigheid van gelabelde nucleotiden en aldus zal het complementaire DNA of cDNA worden verkregen..

Het label kan fluorescerend zijn en moet differentieerbaar zijn tussen de twee te analyseren weefsels. De fluorescente verbindingen Cy3 en Cy5 worden traditioneel gebruikt, omdat ze fluorescentie uitzenden bij verschillende golflengten. In het geval van Cy3 is het een kleur die het dichtst bij rood ligt en Cy5 overeenkomt met het spectrum tussen oranje en geel.

hybridisatie

CDNAs gemengd en werden de coupes geïncubeerd in DNA microarray hybridisatie mogelijk maakt (d.w.z. binding plaatsvindt) cDNA uit beide monsters met het DNA gedeelte geïmmobiliseerd op het vaste oppervlak van de microarray.

Een hoger percentage hybridisatie met de probe in de microarray wordt geïnterpreteerd als een grotere weefselexpressie van het overeenkomstige mRNA.

Systeemuitlezing

De kwantificering van de expressie wordt uitgevoerd door het opnemen van een leessysteem dat een kleurcode toekent aan de hoeveelheid fluorescentie die wordt geëmitteerd door elk cDNA. Als bijvoorbeeld rood wordt gebruikt om de pathologische toestand te markeren en het in grotere mate hybridiseert, is de rode component de overheersende factor..

Met dit systeem is het mogelijk om de overexpressie of de repressie van elk gen dat in beide geselecteerde condities is geanalyseerd te kennen. Met andere woorden, u kunt het transcriptoom van de in het experiment geanalyseerde monsters kennen.

toepassingen

Momenteel worden microarrays beschouwd als zeer krachtige hulpmiddelen op het gebied van geneeskunde. Deze nieuwe technologie maakt de diagnose van ziekten mogelijk en een beter begrip van hoe genexpressie wordt aangepast onder verschillende medische omstandigheden.

Bovendien maakt het de vergelijking mogelijk van een controleweefsel en een weefsel dat met een bepaald medicijn is behandeld, om de effecten van een mogelijke medische behandeling te bestuderen..

Om dit te doen, worden de normale toestand en de zieke toestand vergeleken voor en na de toediening van het medicijn. Bij het bestuderen van het effect van het medicijn op het genoom in vivo je hebt een beter overzicht van het werkingsmechanisme ervan. Bovendien kan worden begrepen waarom bepaalde geneesmiddelen leiden tot ongewenste bijwerkingen.

kanker

Kanker komt bovenaan de lijsten van bestudeerde ziekten met DNA-microarrays. Deze metosologie is gebruikt voor de classificatie en prognose van de ziekte, in het bijzonder in gevallen van leukemie.

Het onderzoeksveld van deze aandoening betreft de compressie en karakterisering van de moleculaire basissen van kankercellen om patronen van genexpressie te vinden die resulteren in fouten in de regulatie van de celcyclus en in de processen van celdood (of apoptose).

Andere ziekten

Via microarrays zijn opgehelderd het differentieel expressieprofielen van genen van medische toestanden van allergieën, immuundeficiënties, autoimmuunziekten (bijvoorbeeld reumatoïde artritis) en infectieziekten.

referenties

  1. Bednar, M. (2000). DNA-microarray-technologie en -toepassing. Medische wetenschapsmonitor, 6(4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, L., Yoshida, T., Randall, J.D., Chow, G., Sarang, S., ... & Gullans, S.R. (2001). DNA-microarray-analyse van complexe biologische processen. Journal of the American Society of Nephrology, 12(5), 1072-1078.
  3. Nguyen, D.V., Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, R.J. (2002). DNA-microarray-experimenten: biologische en technologische aspecten. biometrie, 58(4), 701-717.
  4. Plous, C. V. (2007). DNA-microarrays en hun toepassingen in biomedisch onderzoek. CENIC Magazine. Biologische wetenschappen, 38(2), 132-135.
  5. Wiltgen, M., & Tilz, G.P. (2007). DNA-microarray-analyse: principes en klinische impact. Hematologie, 12(4), 271-287.