DNA-sequencing Maxam-Gilbert, Sanger-methode, voorbeelden

de DNA-sequencing (desoxyribonucleïnezuur) is een procedure die wordt uitgevoerd in laboratoria voor moleculaire biologie die het mogelijk maken de volgorde van nucleotiden in het genetisch materiaal van belang te kennen. Bovendien kan de sequentiebepaling van RNA (ribonucleïnezuur) ook worden onthuld.

Deze techniek is onmisbaar geweest voor de ontwikkeling van de biologische wetenschappen. Het is ook van toepassing op andere kennisgebieden - zoals medische diagnose en forensisch onderzoek, bijvoorbeeld.

Eerder werd de sequentiebepaling van een DNA-streng als een langzame en dure activiteit beschouwd, die de identificatie van slechts enkele baseparen in de oligonucleotiden mogelijk maakte..

Vandaag, met alle vooruitgang van de wetenschap, DNA-sequencing is een routine-operatie in veel laboratoria over de hele wereld, dankzij de bijdrage van bijna 50 jaar onderzoek op dit gebied. Wat de lengte van de ketting betreft, kunt u in zeer korte tijd tot miljoenen baseparen opeenvolgen.

Om dit te doen, zijn er tientallen technieken ontwikkeld die variëren in prijs en nauwkeurigheid. In dit artikel zullen we zowel klassieke als moderne technieken beschrijven, elk met zijn voor- en nadelen.

Tot nu toe maken de sequentietechnieken het mogelijk om de sequentie van complete genomen te verkrijgen, van kleine prokaryoten en gisten tot het menselijk genoom.

index

• 1 Structuur van DNA
• 2 Geschiedenis
• 3 Sanger-methode
  • 3.1 Hoofdcomponenten van de reactie
  • 3.2 De resultaten lezen
• 4 Automatische volgordebepaling
• 5 Maxam-Gilbert-sequencing
  • 5.1 Procedure
  • 5.2 De resultaten lezen
• 6 Massieve sequencing
  • 6.1 Pyrosequencing
  • 6.2 Sequencing door synthese
  • 6.3 Sequencing door ligatie
  • 6.4 Sequencing Ion Torrent
• 7 voorbeelden
  • 7.1 De sequentiebepaling van het menselijk genoom
• 8 belang en toepassingen
• 9 Referenties

Structuur van DNA

Om de methoden en technieken die worden gebruikt voor DNA-sequencing te begrijpen, is het noodzakelijk bepaalde sleutelaspecten van de structuur en de samenstelling van het molecuul te kennen.

DNA is een biomolecuul dat in alle levende wezens voorkomt, van bacteriën tot grote waterdieren. Organellen - zoals mitochondriën en chloroplasten - hebben een cirkelvormig DNA-molecuul erin. Zelfs bij sommige virussen is het gevonden genetisch materiaal DNA.

Structureel is DNA een verzameling nucleotiden. Elk wordt geïntegreerd door een koolhydraat, een stikstofhoudende base (A, T, C of G) en een fosfaatgroep. Het doel van DNA-sequencing is om de volgorde te onthullen waarin de vier stikstofhoudende basen in de sequentie worden gevonden.

geschiedenis

Halverwege de jaren vijftig beschreven onderzoekers Watson en Crick de structuur van DNA met behulp van christologische technieken. Geen van deze onderzoekers had echter een manier gevonden om de volgorde te achterhalen.

Hoewel er waren enkele voorgangers, de belangrijkste gebeurtenis was de oprichting van de Sanger methode, in 1977 Frederick Sanger, de vader van de methode was een Britse biochemicus, winnaar van twee Nobelprijzen voor hun enorme bijdrage aan de biologische wetenschappen.

Deze techniek is ook in de literatuur bekend als "ketenbeëindiging" of dideoxynucleotiden. Vervolgens zullen we de principes van deze techniek beschrijven en die die zijn ontwikkeld op basis van de verbetering en innovatie hiervan.

Sanger's methode

De ontwikkeling van de Sanger-methode was een cruciale gebeurtenis in de moleculaire biologie. Het betreft de basiscomponenten van het DNA-replicatieproces dat normaal in de cel voorkomt, maar door een speciale component toe te voegen: dideoxynucleotiden.

Hoofdcomponenten van de reactie

- DNA-polymerase: het enzym DNA-polymerase is een cruciaal element van het proces. Dit molecuul is betrokken bij de replicatie van het DNA-streng en zijn rol is de synthese van de nieuwe keten, overeenkomende met aanvullende deoxyribonucleotide trifosfaten.

Bedenk dat de DNA thymine (T) samenwerken met adeninen (A) via twee waterstofbruggen, terwijl cytosine (C) maakt met guanine (G) drie bruggen.

- Nucleotiden Sanger sequentiebepaling omvat twee typen nucleotiden, 2'-deoxynucleotiden vier (afgekort als dATP, dGTP, dTTP en dCTP) en de vier dideoxynucleotiden (ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP) Bijzonder.

Hoewel dideoxynucleotiden vergelijkbaar zijn met de monomeren die normaal in DNA worden geïncorporeerd, missen ze een -OH-groep in hun structuur. Dit maakt het onmogelijk om een ​​nieuw nucleotide aan de keten toe te voegen.

Daarom, wanneer een speciaal nucleotide - op een volledig willekeurige manier - wordt toegevoegd aan de keten in formatie, is de synthese verlamd. Op deze manier zijn er aan het einde van de reactie ketens van verschillende groottes, elk waar de reactie op een ander punt werd gestopt.

Experimenteel zijn vier proeven voorbereid. Elk bevat het DNA dat is geëxtraheerd uit het biologische interessante monster, de normale nucleotiden en een van de vier soorten speciale nucleotiden. Of de speciale nucleotiden zijn gemarkeerd met een bepaald type fluorescerende marker (zie hieronder geautomatiseerde volgorde).

Lezing van de resultaten

De eerste stap is om elk van de gesynthetiseerde ketens te scheiden op basis van hun grootte. Sommige zullen langer zijn dan andere, afhankelijk van waar de speciale bases werden opgenomen.

Er zijn verschillende biochemische technieken die de scheiding van de componenten van een mengsel mogelijk maken door de grootte als een discriminerende eigenschap te gebruiken. In de Sanger-methode worden de verschillende ketens gescheiden door elektroforese. In de meest geavanceerde varianten van de techniek wordt capillaire elektroforese gebruikt.

De langere strengen bewegen dus minder dan de kortere varianten. Vervolgens gaat dit systeem door een lezer die de marker herkent die in elk dideoxynucleotide is opgenomen. Op deze manier kan de volgorde van de reeks bekend zijn.

Deze "eerste generatie" -techniek is in staat om DNA-fragmenten niet groter dan 1 kilobase te lezen. Momenteel wordt de Sanger-methode in verschillende laboratoria gebruikt, meestal in moderne varianten. Bovendien wordt het gebruikt om de verkregen resultaten te bevestigen met de meest complexe technieken - maar minder nauwkeurig.

Automatische volgordebepaling

Wanneer grootschalige sequencing nodig is, wordt het proces versneld door automatisering. Dit is een variatie op de Sanger-ketenbeëindigingsmethode, waarbij de primers worden gemarkeerd met fluorescerende producten om ze te onderscheiden.

Vervolgens wordt het product van de reactie in een elektroforese uitgevoerd - allemaal in een enkele rij. Wanneer elk fragment het laatste deel van de gel verlaat, wordt het snel geïdentificeerd door het fluorescerende label, met een fout die 1% omringt.

De meest geavanceerde systemen hebben een systeem van maximaal 96 capillaire buizen die worden bediend door een computer die is gekoppeld aan een robot. Dat wil zeggen 96 DNA-monsters kunnen gelijktijdig worden geëvalueerd. Het proces met elektroforese en de analyse van de resultaten is dus volledig geautomatiseerd.

In één dag kunnen deze systemen tot 550.000 basen rangschikken. Tijdens het proces is menselijk werk niet nodig, het duurt slechts ongeveer 15 minuten om de methode te starten.

Reeksen door Maxam-Gilbert

Op hetzelfde moment dat Sanger zijn werk publiceerde, slaagden twee onderzoekers genaamd Allan Maxan en Walter Gilbert erin een andere methode te ontwikkelen om de DNA-sequentie te verkrijgen. De methode won in die tijd aan populariteit, maar werd later verdrongen door de verbetering van de methode van Sanger.

In tegenstelling tot de Sanger-methode houdt de sequentiebepaling van Maxan en Gilbert (of chemische sequentiebepaling, zoals het ook is) geen hybridisatiereacties in. De methodologie bestaat uit markering met reactieve agentia aan één uiteinde, gevolgd door een zuiveringsproces.

Een van de negatieve aspecten van deze techniek is de enorme complexiteit en het gebruik van chemicaliën die gevaarlijk zijn voor de gebruiker. Chemische defecten worden geïnduceerd door de toepassing van DMS, mierenzuur, hydrazine en hydrazine met zouten.

procédé

Het protocol begint met het labelen aan het 5'-uiteinde van de streng met de fosformarker 32, dan vindt een chemische modificatie van de stikstofbasis plaats en deze wordt gescheiden. Tenslotte vindt de splitsing van het abasische gebied plaats.

Eerst wordt de te sequensen keten ingekort tot kleinere segmenten. Deze stap wordt uitgevoerd met restrictie-enzymen, die uitmonden in uitstekende extremen.

Vervolgens wordt de reactie uitgevoerd met een alkalisch fosfatase, waarvan het doel is om de fosfaatgroep te elimineren. Aldus kan een polynucleotide-kinase worden gebruikt om de labeling uit te voeren.

De ketting is gedenatureerd (de twee strengen open). Daarna gaan we door met het aanbrengen van de chemicaliën. Deze splitsingsreacties worden op een gecontroleerde manier uitgevoerd en welke typen bindingen worden door elke toegepaste chemische stof verbroken.

Lezing van de resultaten

Evenals bij de Sanger-methode omvat het lezen van de resultaten de scheiding op grootte van de ketens verkregen in een elektroforesesysteem. De systemen bestaande uit polyacrylamide maken het mogelijk om een ​​zeer adequate resolutie te verkrijgen voor het lezen van de gel.

Enorme sequencing

Massieve sequencing omvat een reeks nieuwe methoden, afgekort als NGS, van het Engels "Next Generation Sequencing ".

De werkwijzen gecatalogeerd als NGS vereisen een eerdere stap van DNA-amplificatie (ze werken niet met een enkel molecuul). Bovendien variëren de gebruikte platforms sterk. De principes van de meest populaire methoden worden hieronder beschreven:

pyrosequencing

Het houdt in het bewaken van de afgifte van een pyrofosfaat, dat optreedt elke keer dat een nieuw nucleotide aan de DNA-streng wordt toegevoegd. Een enzymsysteem is gekoppeld, zodat lichtemissie (die detecteerbaar is door een camera) optreedt elke keer dat een nieuw nucleotide wordt geïncorporeerd.

Het proces begint met de afzonderlijke incubatie van elke stikstofhoudende base om te verifiëren of er al dan niet lichtemissie is. Pyrosequencing kan het lezen van lange strengen uitvoeren, maar het gevonden foutenpercentage is hoog.

Sequencing door synthese

Dit omvat de incorporatie van gelabelde nucleotiden. Deze fluorescente componenten worden toegevoegd, gewassen en het geïncorporeerde nucleotide wordt genoteerd. Vervolgens wordt het merken van nucleotiden geëlimineerd en de synthese van de streng kan worden voortgezet. In de volgende stap zal ook een gelabeld nucleotide worden opgenomen en de genoemde stappen worden herhaald.

Een nadeel van deze techniek is dat fluorescente markeringen niet volledig worden geëlimineerd. Deze emissies veroorzaken achtergrondfouten, resulterend in aanzienlijke fouten.

Sequencing door ligatie

Deze techniek verschilt van de andere, omdat er geen DNA-polymerase wordt gebruikt. In plaats daarvan is het belangrijkste enzym voor deze methode ligase. Hier worden gebruikte DNA-fragmenten fluorescerend gemerkt, gebonden door het enzym en gedetecteerd.

Het grootste probleem met deze techniek is de zeer korte lengte van het fragment dat kan worden verwerkt.

Ion Sequencing Torrent

Deze techniek is gebaseerd op de meting van het H-ion⁺ die wordt vrijgegeven elke keer dat een nieuw nucleotide wordt geïncorporeerd. Het principe lijkt sterk op pyrosequencing, maar is veel goedkoper.

Voorbeelden

De sequentiebepaling van het menselijk genoom

Sequencing van het genoom van mensen is een van de meest veelbelovende uitdagingen in de biologie geweest, evenals een van de meest gewaardeerde rivaliteiten in de geschiedenis van de wetenschap. Voor de wetenschappers die bij het project betrokken waren, werd het sequencen van het genoom een ​​competitie.

In 1990 startte hij wat 'human genome project' werd genoemd, geleid door de beroemde wetenschapper, winnaar van de Nobelprijs, James Watson. Na een jaar, in 1991, gaat Venter de uitdaging aan om Watson te "verslaan" en het genoom voor hem te sequencen. In het jaar 1992 ging Watson echter met pensioen en werd het bevel door een andere onderzoeker genomen.

In 1995 kondigde Venter zijn succes aan in de volledige sequentiebepaling van een bacterieel genoom volgens de random sequencing-methode. Evenzo kondigde het andere team een ​​jaar later de sequentiebepaling van het gistgenoom aan.

In het jaar 2000 werd de race beëindigd. Beide bedrijven publiceerden hun voorlopige resultaten van het volledige genoom in twee van de meest prestigieuze tijdschriften in de wetenschap: natuur en wetenschap.

Wetenschappers zijn echter blijven werken aan het verbeteren van de voorstellen en in 2006 hebben bepaalde sequenties bepaalde menselijke chromosomen voltooid.

Belang en toepassingen

Het kennen van de volgorde van de nucleotiden van een molecuul zo belangrijk als DNA is waardevol voor biologen en aanverwante professionals. Deze keten van polynucleotiden bevat alle informatie die nodig is voor de ontwikkeling en het onderhoud van alle levensvormen.

Om deze redenen is kennis van deze sequentie essentieel voor biologisch onderzoek. Fundamenteel, sequencing stelt ons in staat om een ​​van de belangrijkste eigenschappen van biologische systemen te meten en om verschillen tussen hen te bepalen.

Sequencing wordt veel gebruikt door taxonomen en systematici, omdat bepaalde DNA-sequenties het vaststellen van criteria mogelijk maken om te concluderen of twee organismen tot dezelfde soort behoren of niet, en ook in staat zijn hypotheses voor te stellen over de fylogenetische relaties daartussen..

Daarnaast heeft DNA-sequencing toepassingen op het gebied van geneeskunde en diagnostiek. Er zijn bijvoorbeeld betaalbare en toegankelijke systemen die ons door middel van sequencing de mogelijkheid bieden om bepaalde ziektes (zoals kanker) te ontwikkelen met behulp van de zogenaamde simple nucleotide polymorphisms (SNP)..

De onderzoeken naar het criminalistische en forensische type zijn ook verrijkt met de sequentietechnieken en kunnen worden gebruikt als betrouwbaar bewijs van de deelname van een bepaald individu aan een misdrijf.

referenties

1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). De sequentie van sequencers: de geschiedenis van het sequencen van DNA. genomics, 107(1), 1-8.
2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). De volgende generatie sequencing-revoluties en de impact ervan op genomics. cel, 155(1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Wetenschappelijke rivaliteit. Van Galileo tot het project voor het menselijk genoom. Paraninfo Editorial.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). DNA-sequencing met keten-beëindigende remmers. Proceedings van de nationale academie van wetenschappen, 74(12), 5463-5467.
5. Schuster, S.C. (2007). De volgende generatie sequencing transformeert de hedendaagse biologie. Natuur methoden, 5(1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Volgende-generatie reeksen. Caister Academic Press.