Voges-Proskauer test foundation, voorbereiding en gebruik

de Voges-Proskauer-test is een biochemische test die wordt gebruikt om bacteriën van de familie Enterobacteriaceae te identificeren. Vooral is het nuttig om stammen van te onderscheiden Escherichia coli van Klebsiella en Enterobacter, onder andere.

De test wordt uitgevoerd in vloeibaar kweekmedium genoemd red Voges Proskauer-methyl, beter bekend onder de afkorting RM / VP. Dit medium bestaat uit gebufferd polypepton, glucose, dikaliumfosfaat en gedestilleerd water.

Het huidige RM / VP-medium is een wijziging van het Clark- en Lubs-medium, dat oorspronkelijk een lagere concentratie van peptonen en glucose bevatte. Daarom werd minder waterstofion geproduceerd, vereist voor de positieve Voges-Proskauer-reactie.

De test is gebaseerd op het vermogen van het micro-organisme om glucose via de butyleenglycolroute te gebruiken en een neutraal eindproduct te vormen, acetoïne, in de aanwezigheid van zuurstof en een alkalische pH.

Temidden RM / VP, naast de mogelijkheid om de Voges-Proskauer tests blijkt, ook de methylrood tests blijkt.

index

• 1 Foundation
  • 1.1 Basis van de Voges-Proskauer-test
  • 1.2 Basis voor de ontwikkeling van de test en interpretatie
• 2 Voorbereiding
  • 2.1 Medium RM / VP
  • 2.2 Voges A Reagent
  • 2.3 Voges B-reagens
• 3 Procedure van de Voges-Proskauer-test
  • 3.1 Ontwikkeling van de test
• 4 Gebruik
• 5 kwaliteitscontrole
• 6 Referenties

stichting

Basis van de Voges-Proskauer-test

De pluripeptonas die in het medium aanwezig zijn, leveren de voedingsvereisten die essentieel zijn voor de groei van bacteriën. Van zijn kant is glucose de belangrijkste verbinding. Veel bacteriën hebben het vermogen om glucose te metaboliseren en pyrodruivenzuur te vormen.

Het pyrodruivenzuur is een middelpunt in het metabolisme van glucose en vandaar kan elk micro-organisme verschillende routes aannemen. Sommige zullen gemengde zuren vormen, zoals melkzuur, azijnzuur, mierenzuur en barnsteenzuur, en andere zullen neutrale producten vormen zoals 2,3-butaandiol.

De Voges-Proskauer-test onthult het vermogen van het micro-organisme om acetylmethylcarbinol (acetoïne) te vormen, een tussenproduct van 2,3-butaandiol onder aerobe omstandigheden.

Acetoïne wordt gereduceerd en vormt 2,3-butaandiol, maar deze reactie is reversibel, dus als 2,3-butaandiol wordt geoxideerd, wordt acetoïne gevormd. Daarom is zuurstof essentieel.

Dipaliumfosfaat is de buffer die het mengsel dempt bij een pH van 6,9 ± 0,2..

Basis voor de ontwikkeling van de test en interpretatie

Aan het reactiemengsel tonen worden uitgevoerd met behulp van twee reagentia geopenbaard (reagentia Barrit) Voges bekend als A en B Voges.

De Voges A is een 5% oplossing van α-naftol en Voges B is samengesteld kaliumhydroxyde 40%. Als kaliumhydroxide niet beschikbaar is, kan het worden vervangen door 40% natriumhydroxide.

A-naftol is een katalysator die de intensiteit van de kleur van de reactie verhoogt, waardoor de test gevoeliger wordt. De α-naftol moet altijd eerst worden toegevoegd, waarbij de buis wordt geroerd, zodat het medium in contact komt met zuurstof. Op deze manier wordt het aanwezige acetoïne geoxideerd tot diacetyl en wordt het 2,3-butaandiol geoxideerd om acetoïne te vormen, waardoor het wordt omgezet in diacetyl.

Op deze manier zal α-naftol binden aan diacetyl, dat op zijn beurt is gekoppeld aan de guanidinenucleus die aanwezig is in het aminozuur arginine, de laatste afkomstig van de pluripeptonas..

Kalium of natriumhydroxide is van zijn kant verantwoordelijk voor het absorberen van CO₂ en reageer met de peptonen. Deze reactie veroorzaakt de vorming van een roze zalmkleur, duidelijk zichtbaar na het goed schudden van de buis.

Om de kleuring onmiddellijk te laten plaatsvinden, moeten de juiste hoeveelheden diacetyl, pepton en α-naftol worden gemengd. Als dit niet gebeurt, laat u de buis 15 minuten rusten voordat u deze interpreteert.

Gewoonlijk is de test na 2 tot 5 minuten positief, wanneer een zwakroze kleur kan worden waargenomen. Als je 30 minuten tot 1 uur in rust bent, is de intensiteit van de kleur maximaal (diep rood).

Een negatieve test zal duidelijk zijn wanneer de bouillon geel is. Na 1 uur, als de test negatief is, kan een koperkleur worden gevormd als gevolg van de reactie van kaliumhydroxide op α-naftol.

voorbereiding

Medium RM / VP

Weeg 17 g van het gedehydrateerde kweekmedium af en los op in 1 liter gedestilleerd water. Laat het 5 minuten staan. Verwarm tot het kookpunt volledig is opgelost. Serveer 3 tot 4 ml in tubes en steriliseer 15 minuten in de autoclaaf bij 121 ° C.

Het gedehydrateerde kweekmedium is beige en het bereide medium is licht-amberkleurig.

De uiteindelijke pH van het medium is 6,9 ± 0,2.

Voges A Reagent

Weeg 5 g a-naftol af en los op in 50 ml ethylalcohol (absoluut). Voeg vervolgens nog ethylalcohol toe om tot 100 ml te maken.

Reagens Voges B

Weeg 40 g kaliumhydroxide af en los op in 50 ml gedestilleerd water in een bekerglas. Het vat moet in een koud waterbad worden geplaatst om de temperatuur te regelen, omdat ten tijde van oplossen van het preparaat stijgt plotseling temperatuur.

Nadat de oplossing koud is, wordt deze overgebracht naar een gegradueerde ballon en met gedestilleerd water tot 100 ml gebracht.

Procedure van de Voges-Proskauer-test

Om de Voges-Proskauer-test uit te voeren, wordt een RM / VP-bouillon geïnoculeerd met het micro-organisme dat wordt bestudeerd, van een zuivere cultuur van 18 tot 24 uur.

Het inoculum moet niet te dicht zijn. Het wordt gedurende 24 tot 48 uur bij 35-37 ° C geïncubeerd, hoewel soms enkele dagen incubatie nodig is. Cowan en Steel geloven dat 5 dagen de minimale incubatietijd is die nodig is om alle positieve Voges-Proskauer (VP) -soorten van de familie Enterobacteriaceae te detecteren.

Ontwikkeling van de test

Scheid een 1 ml monster in een buis en voer de ontwikkeling als volgt uit: plaats 12 druppels (0,6 ml) Voges A-reagens en 4 druppels (0,2 ml) Voges B. Meng om te laten luchten en laten staan gedurende 5 - 10 minuten voordat u begint met spelen. Als de test echter nog steeds negatief is, laat hem dan staan ​​en observeer de tube na 30 minuten tot 1 uur.

Het uiterlijk van een rozerode kleur geeft aan dat de Voges-Proskauer-reactie positief is. Als het medium geel blijft, is de reactie negatief.

De toevoeging van de ontwikkelaars in de aangegeven volgorde en hoeveelheid is essentieel om valse negatieven te voorkomen.

gebruik

De Voges-Proskauer-test is nuttig om onderscheid te maken tussen stammen van E. coli die VP-negatief zijn, van de genera Klebsiella, Enterobacter, Serratia, onder anderen, die VP-positief zijn.

Kwaliteitscontrole

Controlestammen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit van het bereide medium te testen. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium en Enterobacter cloacae ATCC 13047.

De verwachte resultaten zijn alleen positieve reacties van Voges-Proskauer K. pneumoniae en E. cloacae. De rest geeft negatieve reacties.

referenties

1. Laboratoria Britania. MR-VP Medium. 2015. Beschikbaar op: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Beschikbaar: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemische tests voor de identificatie van bacteriën van klinisch belang. 3e druk Redactioneel Panamericana. Buenos Aires Argentinië.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Microbiologische diagnose van Bailey & Scott. 12 ed. Redactioneel Panamericana S.A. Argentinië.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana S.A. Argentinië.