Spore kleuringsbasis, technieken en toepassingen

de sporenkleuring is de methodologie die wordt gebruikt om de weerstandsstructuren te kleuren die bepaalde bacteriesoorten vormen wanneer ze zich in ongunstige omstandigheden bevinden; deze structuren corresponderen met een manier van overleven.

Er zijn veel geslachten die sporen vormen; de belangrijkste zijn echter Bacillus en Clostridium. Deze geslachten worden als relevanter beschouwd omdat ze pathogene soorten voor mensen hebben.

Elke bacillus kan aanleiding geven tot een spore. Op het moment van het verven van het preparaat, kan de sporen worden gevonden in de bacillus (endospore) of daarbuiten (exospore). Met conventionele kleurtechnieken voor bacteriën - zoals Gram-kleuring - blijven de sporen kleurloos.

Momenteel zijn er verschillende kleurmethodes die in staat zijn de dikke structuur van de sporen te doorkruisen om deze te verven. Deze methodologieën zijn zeer gevarieerd; Hieronder kunnen we de Dorner-techniek, de Möeller-kleuring en de Shaeffer-Fulton-methodiek noemen, ook bekend als Wirtz-Conklin..

Van alle genoemde technieken is de Shaeffer-Fulton-methode het meest gebruikt in routinelaboratoria. Het dankt zijn naam aan twee microbiologen die in 1930 de kleuring hebben gecreëerd: Alicia Shaeffer en MacDonald Fulton. Soms wordt de techniek echter Wirtz-Conklin genoemd ter ere van twee bacteriologen uit de jaren 1900.

index

• 1 Foundation
• 2 Spore-kleurtechnieken
  • 2.1 De techniek van Dorner
  • 2.2 Modified Dorner-techniek
  • 2.3 Techniek van Shaeffer-Fulton of Wirtz-Conklin
  • 2.4 Möeller-techniek
  • 2.5 Modified Möeller-techniek zonder warmte
• 3 Gebruik
  • 3.1 Voorbeelden
• 4 Referenties

stichting

De sporen beitsen niet met conventionele kleuringen omdat ze een zeer dikke wand hebben. De complexe samenstelling van de sporen voorkomt de invoer van de meeste kleurstoffen.

Als de sporen van buitenaf naar binnen worden bestudeerd, worden de volgende lagen waargenomen: ten eerste het exosporium, dat de dunste buitenlaag is die wordt gevormd door glycoproteïnen..

Daarna komt de cuticula, die weerstand biedt tegen hoge temperaturen, gevolgd door de cortex die bestaat uit peptidoglycaan. Dan is er de muur van de basis die de protoplast beschermt.

De sporen zijn een gedehydrateerde structuur die 15% calcium en dipicolinezuur bevat. Daarom zijn de meeste sporenkleuringstechnieken gebaseerd op de toepassing van warmte, zodat de kleurstof de dikke structuur kan binnendringen.

Zodra de sporen zijn geverfd, kan deze de kleurstof niet verwijderen. In de Shaeffer-Fulton-techniek komt malachietgroen de vegetatieve cellen binnen en doordringt, bij toepassing van warmte, de endospore en ook de exosporen.

Bij wassen met water wordt de kleurstof verwijderd uit de vegetatieve cel. Dit komt omdat de groene malachietkleurstof enigszins basisch is, dus het bindt zwak aan de vegetatieve cel.

Aan de andere kant kan het niet uit de sporen komen en uiteindelijk wordt de bacillus met safranin gecontrasteerd. Deze stichting is geldig voor de rest van de technieken, waarbij iets soortgelijks gebeurt.

Spore kleurtechnieken

Om de sporen vlekkerig te maken, moet je een pure cultuur hebben van de verdachte soort die je wilt bestuderen.

De kweek wordt onderworpen aan extreme temperaturen gedurende 24 uur om het micro-organisme te stimuleren om te sporuleren. Hiervoor kan de kweek gedurende 24 of 48 uur in een oven bij 44 ° C of in een koelkast (8 ° C) worden geplaatst.

Als er te veel tijd overblijft bij de genoemde temperaturen, zullen alleen exosporen worden waargenomen, omdat alle endosporen de bacillus hebben verlaten.

Aan het einde van de tijd moeten enkele druppels steriele fysiologische oplossing op een schone glijbaan worden geplaatst. Vervolgens wordt een klein deel van het gewas genomen en een fijne spread gemaakt. 

Daarna laat men het drogen, het zit vast aan de hitte en het is gekleurd met enkele van de technieken die hieronder worden uitgelegd:

De techniek van Dorner

1- Bereid in een reageerbuis een geconcentreerde suspensie van het gesporuleerde micro-organisme in gedistilleerd water en voeg een gelijk volume gefilterd Kinyoun-fenolisch fuchsine toe..

2- Plaats de buis in een bad met kokend water gedurende 5 tot 10 minuten.

3- Meng op een schoon glaasje een druppel van de vorige suspensie met een druppel 10% nigrosine-oplossing in water, gekookt en gefilterd.

4- Verleng en droog snel met milde hitte.

5- Onderzoek met 100X-doelstelling (onderdompeling).

De sporen kleuren rood en de bacteriecellen lijken bijna kleurloos tegen een donkergrijze achtergrond.

Gemodificeerde Dorner-techniek

1- Een suspensie van het gesporuleerde micro-organisme wordt op een glaasje uitgespreid en aan de hitte gefixeerd.

2- Het monster wordt bedekt met een strook filtreerpapier waaraan fenisch zuur fuchsine wordt toegevoegd. De kleurstof wordt gedurende 5 tot 7 minuten verwarmd met de vlam van de Bunsen-brander tot het vrijkomen van dampen plaatsvindt. Vervolgens wordt het papier verwijderd.

3- Was het preparaat met water en droog het vervolgens met absorberend papier.

4- Bedek het uitstrijkje met een dunne film van 10% nigrosin, gebruik een tweede dia om de nigrosin of een naald te verspreiden.

De verkleuring door sporen en bacteriën is hetzelfde als die beschreven in de stand van de techniek.

Shaeffer-Fulton of Wirtz-Conklin-techniek

1- Maak een dun smeersel met een suspensie van het gesporuleerde micro-organisme op een glaasje en fixeer het om te verwarmen.

2- Bedek de dia met een waterige oplossing van 5% malachietgroen (een filterpapier kan op het vel worden gelegd).

3- Verwarm op de vlam van de bunsenbrander om stoom te laten ontsnappen en verwijder de vlam. Herhaal de bewerking gedurende 6 tot 10 minuten. Als tijdens de procedure de groene malachietoplossing te veel verdampt, kan er meer worden toegevoegd.

4- Verwijder het filterpapier (als het geplaatst was) en was met water.

5- Bedek de schuif gedurende 30 seconden met 0,5% waterige safranine (sommige varianten van de techniek gebruiken 0,1% waterige safranine en laten deze gedurende 3 minuten).

Met deze techniek zijn de sporen groen en zijn de bacillen rood.

Het heeft het nadeel dat de endosporen van jonge culturen niet goed kleuren, omdat ze er extreem helder of kleurloos uitzien. Om dit te voorkomen, wordt aanbevolen om culturen van 48 uur incubatie te gebruiken.

Möeller-techniek

1- Bedek het uitstrijkje met chloroform gedurende 2 minuten.

2- Gooi de chloroform weg.

Dek af met 5% chroomzuur gedurende 5 minuten.

4- Was met gedestilleerd water

5- Het laken is bedekt met fuchsin-fenolische karper en blootgesteld aan de vlam van de bunsenbrander tot de uitstoot van dampen; dan wordt het voor een paar ogenblikken uit de vlam gehaald. De bewerking wordt herhaald totdat deze 10 minuten bereikt.

6- Was met water.

7- Gebruik verzuurde ethanol (zoutzuur alcohol) om te ontkleuren. Het wordt 20 of 30 seconden gelaten.

8- Was met gedestilleerd water.

9- Tegenwerkend bedekken van het vel met methyleenblauw gedurende 5 minuten.

10- Was met gedestilleerd water.

11- Het wordt gelaten om te drogen en het monster wordt onder een microscoop genomen.

De sporen zien er rode en blauwe bacillen uit. Het is belangrijk om de dampen niet in te ademen, omdat ze giftig zijn en op de lange termijn kankerverwekkend kunnen zijn.

Gemodificeerde Möeller-techniek zonder warmte

In 2007 creëerden Hayama en zijn medewerkers een aanpassing van de Möeller-techniek. Ze verwijderden de verhittingsstap van de kleurstof en verving deze door toevoeging van 2 druppels van de oppervlakteactieve Tergitol 7 voor elke 10 ml fuchsin-fenol-carboloplossing. Dezelfde resultaten werden verkregen.

toepassingen

De kleuring van de sporen biedt een zeer waardevolle en nuttige informatie voor de identificatie van het pathogeen, omdat de aanwezigheid van hetzelfde, de vorm, de locatie binnen de bacillus en het vermogen om de vegetatieve cel te vervormen of niet, gegevens zijn die de soort kunnen geleiden. betrokken bij een bepaald geslacht.

In dit verband is het vermeldenswaard dat de sporen rond of ovaal kunnen zijn, ze kunnen zich in het midden of ook in een paracentrale, subterminale of eindpositie bevinden.

Voorbeelden

- Clostridium difficile vormt een ovale spore in eindpositie die de bacil vervormt.

- De sporen van Clostridium tertium Het is ovaal, vervormt de bacillus niet en bevindt zich op het terminalniveau.

- De endospore van Clostridium tetani het is terminaal en vervormt de bacil, wat de indruk geeft van een drumstick.

- De sporen van Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. Novy en C. septicum ze zijn rond of subterminaal ovaal en vervormen de bacillus.

- De endospore van Clostridium sordelli het bevindt zich in de centrale positie, met een lichte vervorming.

referenties

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Voorstel voor een vereenvoudigde techniek voor het kleuren van bacteriesporen zonder toepassing van een met warmte geslaagde wijziging van de Moeller-methode. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Bijdragers van Wikipedia. Moeller-kleuring. Wikipedia, de gratis encyclopedie. 3 november 2018, 03:28 UTC. Beschikbaar op: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratoriumhandboek voor microbiologische technieken. Departement Basale wetenschappen Academie voor Microbiologie. Nationaal Polytechnisch Instituut.
4. "Endospore." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 25 februari 2018, 10:20 UTC. 10 januari 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J en medewerkers. (2006). Arbeidskrachten van de autonome gemeenschap Extremadura. Specifieke agenda Volume IV. Redactie MAD. Sevilla-Spanje, pp 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), gespecialiseerde laboratoriumtechnicus van de Galicische gezondheidsdienst (SERGAS). Specifieke inhoud van de stof 2. Redactie MAD. Sevilla-Spanje, pp 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. (5de ed.). Argentinië, redactie Panamericana S.A..
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Microbiologische diagnose van Bailey & Scott. 12 ed. Argentinië. Panamericana S.A Editorial