Agar M.R.S foundation, voorbereiding en gebruik



de agar M.R.S. is een selectief vast kweekmedium, gebruikt voor de isolatie en het tellen van melkzuurbacteriën, in het bijzonder van het geslacht Lactobacillus. Deze agar werd in 1960 gemaakt door Man, Rogosa en Sharpe, de middelste met dezelfde naam, maar vanwege de complexiteit ervan wordt vaak de afkorting M.R.S gebruikt..

Het bestaat uit proteosepepton, vleesextract, gistextract, glucose, sorbitanmonooleaat, dikaliumfosfaat, natriumacetaat, ammoniumcitraat, magnesiumsulfaat, mangaansulfaat en agar.

Deze samenstelling maakt een goede ontwikkeling van melkzuurbacteriën uit klinische monsters zoals ontlasting, vaginale afscheiding, moedermelk monsters en orale en vlees en melkproducten.

Het wordt niet routinematig gebruikt in klinische laboratoria, omdat melkzuurbacteriën zelden betrokken zijn bij pathologische processen. Het gebruik van M.R.S-agar komt echter vaker voor op het gebied van voedselmicrobiologie..

Anderzijds wordt dit medium door sommige onderzoekscentra gebruikt, waarvan het doel de studie van melkzuurbacteriën is.

index

  • 1 Foundation
  • 2 Voorbereiding
  • 3 Gebruik
    • 3.1 Kenmerken van de koloniën
    • 3.2 Isolatie van melkzuurbacteriën
    • 3.3 Tellen van melkzuurbacteriën
    • 3.4 Op onderzoeksniveau
  • 4 Kwaliteitscontrole
  • 5 Referenties

stichting

De agar Man, Rogosa en Sharpe heeft een vrij complexe compositie. Door de functie die elk van zijn componenten vervult te ontbinden, kan de basis ervan worden uitgelegd.

Proteose-pepton, vleesextract, gistextract en glucose zijn voedingsstoffen die de bron vormen van koolstof, stikstof, vitamines en mineralen die nodig zijn voor de groei van bacteriën. Bovendien is glucose de universele energiebron die in de meeste kweekmedia wordt gebruikt.

Bovendien, om de groei van melkzuurbacteriën te bevorderen, moet de aanwezigheid van cofactoren (kationen) onmisbaar bij het metabolisme van Lactobacillus en verwante bacteriën; Deze verbindingen zijn de natrium-, magnesium- en mangaanzouten.

Evenzo zijn sorbitanmonolaat of polysorbaat 80 een bron van belangrijke vetzuren wanneer het als voedingsstoffen wordt geabsorbeerd.

Bovendien werken sorbitanmonolaat en ammoniumcitraat door het remmen van de ontwikkeling van de bijbehorende flora, in het bijzonder Gram-negatieve bacteriën, die het selectieve karakter van deze agar verschaffen..

Tot slot, agar-agar geeft de vaste consistentie aan het medium.

Er zijn andere varianten van Man Rogosa Sharpe-agar; een daarvan is degene die is aangevuld met cysteïne (M.R.S.c), zeer bruikbaar voor de isolatie van bifidobacteriën, naast andere micro-organismen. Bovendien is er het MRS-medium aangevuld met neomycine, paromomycine, nalidixinezuur en lithiumchloride, in het bijzonder voor de selectieve telling van bifidobacteriën in zuivelproducten.

voorbereiding

Weeg 68,25 gram van het gedehydrateerde medium af en los op in 1 liter gedestilleerd water. Laat het 5 minuten staan. Om in zijn geheel op te lossen, breng het mengsel vaak onder roeren aan en laat het 1 à 2 minuten koken. Steriliseer in een autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 ° C.

Laat de autoclaaf een paar minuten staan ​​en verdeel hem nog heet in steriele petrischalen.

Laat stollen en draai de platen om, bestel in plaquers en bewaar in de koelkast tot gebruik. Laat de platen op kamertemperatuur komen voordat u ze gebruikt.

De pH van het medium moet 6,4 ± 0,2 zijn. Sommige commerciële huizen adviseren pH tussen 5,5 tot 5,9.

Het gedehydrateerde medium is beige en bereid is donker amberkleurig.

Zowel het gedehydrateerde medium als de bereide platen moeten worden bewaard bij 2 tot 8 ° C.

toepassingen

De agarplaten M.R.S. ze kunnen op het oppervlak worden gezaaid (uitputting of met een spatel van Drigalski). Het kan ook op diepte worden gezaaid. Platen moeten worden geïncubeerd bij 37 ° C in micro-aerofiele (4% O2 en 5-10% CO2) gedurende 24 tot 72 uur.

De entmethode wordt gekozen volgens het nagestreefde doel (isolatie of tellen).

Kenmerken van de koloniën

De vermoedelijke kolonies van Lactobacillus groeien witachtig en hebben een mucoïde of romige uitstraling op deze agar. Dan moeten ze identificeren.

Isolatie van melkzuurbacteriën

Voor dit doel wordt het planten op oppervlak gebruikt. De te planten monsters vereisen een eerdere procedure. 

In het geval van moedermelkmonsters verdient het aanbeveling om gedurende 10 minuten 1 ml van het monster bij 14.000 rmp te centrifugeren om de vetlaag te verwijderen. 900 μl wordt weggegooid en in de overblijvende 100 μl wordt het sediment gesuspendeerd en op de M.R.S. gegoten. Dan moet het gelijkmatig worden verdeeld met een spatel Drigalski.

In het geval van ontlastingsmonsters, wordt één (1) gram faeces gewogen en gehomogeniseerd in 9 ml 0,1% steriel peptonwater, overeenkomend met een 1/10 verdunning. Vervolgens worden seriële verdunningen gemaakt, totdat een uiteindelijke verdunning van 10 wordt verkregen-4.

Uiteindelijk wordt 100 μl van de verdunningen 10 genomen-2, 10-3 en 10-4 en elke verdunning wordt gezaaid op MRS-agar en uniform verdeeld met een Drigalski-spatel.

Tellen van melkzuurbacteriën

In dit geval gebeurt het zaaien op diepte.

Neem voor monsters van moedermelk 1 ml en plaats het in een steriele conische plastic buis. MRS-agar wordt toegevoegd bij een temperatuur van ongeveer 40 ° C tot een eindvolume van 25 ml, waarbij een homogeen mengsel wordt verkregen. Vervolgens wordt het op een uniforme wijze in steriele petrischalen gegoten en men laat het staan ​​totdat het polymeriseert..

Verdunningen worden gemaakt voor monsters van ontlasting, zoals hierboven beschreven. Neem 1 ml van elke verdunning en plaats deze in steriele conische plastic tubes. Gesmolten MRS-agar wordt toegevoegd tot een volume van 25 ml.

Het mengsel van elke verdunning wordt uniform in steriele petrischalen gegoten. Laat het tenslotte staan ​​tot het polymeriseert.

Op het niveau van onderzoek

Elke dag wordt de studie van melkzuurbacteriën interessanter; vooral onderzoekers proberen nieuwe stammen en hun potentieel te kennen als initiërende gisten voor standaardisatie bij de vervaardiging van zuivelproducten, naast andere toepassingen.

In deze zin, Alvarado et al. (2007) gebruikte de M.R.S.-agar. om een ​​studie uit te voeren waarin ze melkzuurbacteriën die voorkomen in een artisanale gerookte Venezolaanse kaas isoleren, identificeren en karakteriseren.

In kaas vonden zij de aanwezigheid van bacteriën van de genera Lactococcus en Lactobacillus en concludeerde dat de isolaten mengsels zijn geschikt als starter spanningen bij de bereiding van kaas uit gepasteuriseerde melk.

Aan de andere kant, Sánchez et al. (2017) gebruikte M.R.S-agar. om de aanwezigheid van melkzuurbacteriën in het spijsverteringskanaal van biggen te onderzoeken, om ze te gebruiken als natieve probiotica die de productiviteit van gezonde biggen verhogen.

Met dit medium slaagden ze erin vier soorten te isoleren: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae en Pediococcus pentosaceus.

Evenzo, Báez et al. (2019) gebruikte M.R.S.-agar. om melkzuurbacteriën (BAL) en bifidobacteriën te evalueren met probiotisch potentieel in moedermelk en ontlasting van zuigelingen.

Ze slaagden erin 11 BAL en 3 te isoleren Bifidobacteria sp in moedermelk, en 8 BAL en 2 Bifidobacteria sp. in ontlasting Alle voldeden aan bepaalde parameters die ze accrediteren als bacteriën met probiotische activiteit.

De auteurs concludeerden dat zowel moedermelk als uitwerpselen van uitsluitend zuigelingen die borstvoeding krijgen, dienen als natuurlijke bronnen van probiotische bacteriën.

Kwaliteitscontrole

Om de kwaliteit van M.R.S. te evalueren controlestammen kunnen worden gebruikt zoals:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli en Bacillus cereus.

De verwachte resultaten zijn bevredigende groei voor de eerste 6 bacteriën, terwijl E. coli en Bacillus cereus moet in zijn geheel worden geremd.

referenties

  1. Alvarado C, Chacon Z, J Otoniel, Guerrero B, G. Lopez isolatie, identificatie en karakterisering van melkzuurbacteriën van een kaas Venezolaanse Artisan Gerookte Andino. Het gebruik als startercultuur. Cient. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Beschikbaar op: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Isolatie van melkzuurbacteriën uit de spijsverteringskanaal van de big. Rev. onderzoek. dierenarts. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Beschikbaar op: scielo.org.
  3. Baez E, González G, Hernandez G, Lopez E, Mega M. Evaluatie van melkzuurbacteriën en bifidobacteriën met probiotische potentieel in de moedermelk en kindervoeding uitwerpselen in de stad Acevedo, Miranda 2017. Degree werk voor de mate van afgestudeerden bioassays. Universiteit van Carabobo, Venezuela.
  4. British Laboratory M.R.S-agar. 2015. Beschikbaar op: britanialab.com
  5. Bijdragers van Wikipedia. MRS agar Wikipedia, de gratis encyclopedie. 10 januari 2018, 19:44 UTC. Beschikbaar op: wikipedia.org Toegang tot 17 februari 2019.
  6. Roy D. Media voor de isolatie en opsomming van bifidobacteriën in zuivelproducten. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.