Agar Müeller Hinton foundation, bereiding en toepassingen

de Müeller Hinton agar Het is een vast, niet-selectief voedingsmedium, dat is samengesteld uit vleesinfusie, caseïnezuurpepton, zetmeel, agar en gedistilleerd water. Dit medium maakt een uitstekende microbiële ontwikkeling van de snelstgroeiende bacteriën mogelijk.

Het is oorspronkelijk gemaakt door John Howard Müeller en Jane Hinton om qua voedingswaarde veeleisende bacteriën te isoleren, zoals Neisseria gonorrhoeae en Neisseria meningitidis. Vanwege zijn eigenschappen bleek het echter ideaal voor het bestuderen van de gevoeligheid voor antibiotica, waardoor betrouwbare en reproduceerbare resultaten werden verkregen.

Daarom is de Mueller Hinton agar is het kweekmedium door de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en het Europees Comité voor tests op antimicrobiële resistentie aanvaard voor de uitvoering van tests op antimicrobiële resistentie door diffusie methode disk Kirby en Bauer.

index

• 1 Foundation
• 2 Voorbereiding
• 3 Gebruik
  • 3.1 Antimicrobiële techniek
  • 3.2 Strategische plaatsing van schijven op Müeller Hinton-agar
• 4 Oorzaken van foutieve resultaten
• 5 Beperking
• 6 Kwaliteitscontrole
• 7 Referenties

stichting

Omdat het een niet-selectief voedingsmedium is, is het uitstekend voor de groei van de meeste pathogene bacteriën.

Anderzijds zorgt de eenvoudige samenstelling ervoor dat de stoffen gemakkelijk diffunderen, wat een essentieel kenmerk is van de gevoeligheidstest door de schijfdiffusiemethode..

Een ander kenmerk is dat het een kleine hoeveelheid remmers bevat, waardoor sulfonamiden, trimethoprim en tetracyclines effectief kunnen worden geëvalueerd..

Er moet echter rekening mee worden gehouden dat het medium aan bepaalde voorwaarden moet voldoen om de goede werking ervan te waarborgen, waaronder:

PH-aanpassing, agar-diepte en adequate concentratie van thymine, thymidine, Ca⁺⁺, mg⁺⁺ en Zn⁺⁺.

We moeten ook weten dat de methodiek gestandaardiseerd is en dat daarom aan alle parameters moet worden voldaan, zoals:

De concentratie van het inoculum, de concentratie en conservering van de antibioticumschijven, de plaatsing van het juiste aantal schijven op de agar, de afstand tussen de ene schijf en de andere, de strategische plaatsing van bepaalde antibiotica, de atmosfeer, de temperatuur en het tijdstip van incubatie.

voorbereiding

Weeg 37 g van het gedehydrateerde Müeller Hinton-medium af en los het op in 1 liter gedestilleerd water. Verhit het medium onder roeren om het te helpen oplossen. Laat het 1 minuut koken.

Neem de autoclaaf om gedurende 15 minuten bij 121 ° C te steriliseren. Bij verwijdering uit de autoclaaf moet de fiola in een waterbad bij 50 ° C worden geplaatst om af te koelen. Giet 25 tot 30 ml in steriele Petrischalen met een diameter van 10 cm.

De platen moeten een gemiddelde dikte hebben van 4 mm (ideaal), met een bereik van 3-5 mm toegestaan.

Als het gewenst is om bloedagar te bereiden met behulp van Müeller Hinton-agarbasis, wordt 5% steriel en gedefibrineerd lambloed gegoten voordat het op de platen wordt geserveerd..

De uiteindelijke pH van het medium moet tussen 7,2 en 7,4 liggen.

Investeer en bewaar in een koelkast, tot gebruik. Laat de plaat op kamertemperatuur komen voordat u hem gebruikt.

De kleur van het geprepareerde medium is lichtbeige.

toepassingen

Het wordt gebruikt om de antibioticumgevoeligheidstest uit te voeren voor de meeste niet-snelgroeiende pathogenen.

Als de agar wordt aangevuld met bloed, dient het om het antibiogram van veeleisende micro-organismen uit te voeren, zoals: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, onder andere. Het is ook gebruikt om te isoleren Legionella pneumophila.

Antibiogramtechniek

Voordat het antibiogram wordt uitgevoerd, moet een bacteriële oplossing van 1,5 x 10 worden bereid⁸ cel.

Hiertoe neemt 3-4 kolonies van zuivere cultuur en zijn gesuspendeerd in een soja bouillon of trypticase Mueller Hinton bouillon gedurende 2-6 uur en de concentratie werd met steriele zoutoplossing, vergeleken met een standaard van McFarland 0,5%.

Als ze micro-organismen eisen, kunnen kolonies direct worden opgeschort totdat ze de concentratie van 0,5% van Mac Farland bereiken. Vervolgens wordt de Müller Hinton-plaat gezaaid met een wattenstaafje geïmpregneerd met de bereide bacteriële oplossing.

Om dit te doen, dompelt u de swab in de oplossing en vervolgens de overtollige vloeistof door te drukken tegen de wanden van de buis. Direct nadat het staafje over het gehele oppervlak is gepasseerd en geen onaangetaste plaatsen achterlaat, draai de plaat dan iets en zaai opnieuw. De bewerking wordt nog 2 keer herhaald.

Laat 10 minuten staan ​​en plaats de antibioticumschijven met een steriel pincet, met een ruimte van 24 mm ertussen. Na het plaatsen van elke schijf op de agar drukt u lichtjes op elke schijf met de klem om ervoor te zorgen dat ze goed worden geplakt.

Na het proces wordt de plaat omgekeerd en geïncubeerd bij 35-37 ° C in aerobiose gedurende 16 tot 18 uur. Als het een veeleisend micro-organisme is, kan het micro-erofilie vereisen en als het antibiogram oxacilline-schijven bevat, moet het na 24 uur worden gelezen..

Een liniaal wordt gebruikt om de diameter van elke halo te meten. De resultaten moeten worden vastgelegd in mm. Vervolgens worden de verkregen waarden gecorreleerd met de tabellen met knippunten die zijn gepubliceerd door de huidige CLSI-handleiding.

Rapporteer als gevoelig (S), intermediair (I) of resistent (R), naargelang het geval.

Antibiotica worden geselecteerd op basis van het geïsoleerde micro-organisme en het type infectie dat optreedt.

Soms moet de strategische plaatsing van antibiotica worden overwogen om fenotypische resistentiepatronen te vertonen.

Strategische plaatsing van schijven op Müeller Hinton-agar

Voor enterobacteriën moet de clavulaanzuurschijf voor de 3e en 4e generatie cefalosporinen worden geplaatst. Een eivormige verwijding geeft aan dat de stam een ​​producent is van breed-spectrum beta-lactamasen (ESBL). Dit betekent dat de patiënt niet met cefalosporine mag worden behandeld.

Bij Staphylococcus is het belangrijk om de erytromycine of azithromycine schijf voor de clindamycine schijf te plaatsen (D-test).

Een resistente halo in erythromycine en een afvlakking in de clindamycine halo geeft aan dat de stam een ​​induceerbare resistentie tegen clindamycine, stam (RIC) heeft. Dit betekent dat een behandeling met clindamycine niet effectief zal zijn.

Zoeken AMP C induceerbare stammen Enterobacteriaceae en bepaalde niet-fermenterende gramnegatieve bacillen, schijven ceftazidim, cefoxitine piperacilline of tazobactam versus imipenem schijfoppervlak op een afstand van 27 mm.

Een halo afgeplat in een van de schijven tegenover imipenem wijst op de aanwezigheid van induceerbare AMP C.

Voor het zoeken naar constitutieve AMP C wordt een cloxacilline 500 μg schijf geconfronteerd met ceftazidime (30 μg) en met cefotaxime (30 μg) op een afstand van 25 mm. Een verbrede halo in een van de cefalosporines duidt positiviteit aan.

De cloxacilline schijf kan ook worden vervangen door een schijf van 9 mm Whatman No. 6 filterpapier geïmpregneerd met fenylboronzuur (400 μg) met een afstand van 18 mm. Het wordt hetzelfde geïnterpreteerd als het vorige.

Ten slotte, om de productie van metallo-beta-lactamasen te onderzoeken, vooral in Pseudomonas aeruginosa, geïmpregneerd schijf gebruikt met 10 ul ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA 750 g) en thioglycolzuur (SMA 300 mg), die imipenem en meropenem schijven gezichten, op een afstand van 15 mm.

De test is positief als er een uitbreiding is van de imipenem- of meropenemhalo's naar de EDTA / SMA-schijf. Dit resultaat moet worden bevestigd door de gewijzigde Hodge-test.

Deze methode bestaat uit het inenten van een stam van Escherichia coli ATCC 25922 op de Müeller Hinton-plaat. Een imipenemschijf wordt in het midden van de plaat geplaatst en dan wordt een fluit gemaakt van de schijf naar de omtrek met de spanning van P. aeruginosa verdacht. U kunt tot 4 stammen per plaat testen.

De test zal positief zijn als er een vervormingszone van de imipenemhalo rond de stria is.

Oorzaken van foutieve resultaten

-Schijven van slecht bewaarde antibiotica kunnen valse resistenties produceren. De oxacillineschijf is bijvoorbeeld erg kwetsbaar voor temperatuurveranderingen.

-Een pH van het medium onder de aangegeven (zuur) geeft kleinere halo's in aminoglycosiden en macroliden (risico op vals resistentie), en grotere halo penicilline, tetracycline en novobiocine (kans op valse gevoeligheid).

-Als de pH boven de aangegeven (alkalische) pH ligt, zijn de hierboven beschreven effecten omgekeerd.

-Media met hoge thymine- en thymidineconcentraties beïnvloeden significant de remminghalo's van sulfonamiden en trimethoprim.

-Hoge concentraties calcium en magnesium produceren valse resistentie van aminoglycosiden, polymyxine B en tetracyclines tegen stammen van Pseudomonas aeruginosa.

-Lage concentraties calcium en magnesium produceren valse gevoeligheden van aminoglycosiden, polymyxine B en tetracyclines tegen stammen van Pseudomonas aeruginosa.

-De aanwezigheid van zink beïnvloedt de resultaten van de carbapenems-schijven (imipenem, meropenem en ertapenem).

-De dikte van het medium onder 3 mm produceert resultaten met valse gevoeligheid, terwijl een dikte van meer dan 5 valse weerstand zal produceren.

-De mobilisatie van schijven in het antibiogram geeft misvormde halo's, omdat de antibiotische ontlading onmiddellijk is.

- Zeer zwakke inoculums beïnvloeden de resultaten, omdat er geen uniforme of samenvloeiende groei in de agar zal zijn, een noodzakelijke voorwaarde om de inhibitiezones te kunnen meten, naast het feit dat de halo's groter kunnen zijn dan normaal.

-Overladen inocula kan halo's kleiner dan normaal geven.

-Als de afstand tussen schijven niet wordt gerespecteerd, veroorzaakt de ene halo een andere en kan deze niet correct worden gelezen.

-Incubeer met CO₂ vergroot de grootte van de halo's van tetracycline- en methicillinedisks.

-Incubatie bij temperaturen onder 35 ° C produceert grotere halo's.

-De toevoeging van bloed verlaagt de halo-afmeting van de sulfonamiden.

beperking

De gevoeligheid van een antibioticum aangetoond in het antibiogram tegen een micro-organisme (in vitro) is geen garantie dat het zal werken in vivo.

Kwaliteitscontrole

Om te weten of het medium de juiste hoeveelheid thymine bevat, moet een stam worden gezaaid van Enterococcus faecalis ATCC 29212 en test de gevoeligheid voor trimethoprim sulfamethoxazol (SXT), het moet een halo gelijk of> 20 mm geven om bevredigend te zijn.

referenties

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 16 november 2018, 12:23 UTC. 27 januari 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Microbiologische diagnose van Bailey & Scott. 12 ed. Redactioneel Panamericana S.A. Argentinië.
3. Cona E. Voorwaarden voor een goede gevoeligheidsstudie door agar-diffusietest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratorium. Müeller Hinton-agar met 5% schapenbloed. 2009. Beschikbaar op: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar-laboratorium. 2017. Beschikbaar op: .bd.com
6. Laboratoria Britania. Müeller Hinton agar. 2015. Beschikbaar op: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana S.A. Argentinië.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas type AmpC: algemeen en methoden voor fenotypische detectie. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Beschikbaar op: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypische detectie van metallobetalactamasen in klinische isolaten van Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Beschikbaar op: scielo.org.