Endonucleasen functies en typen



de endonucleasen zijn enzymen die de fosfodiesterbindingen knippen die zich binnen de nucleotide-keten bevinden. De restrictieplaatsen van endonucleasen zijn zeer gevarieerd. Sommige van deze enzymen knippen bijna overal DNA (deoxyribonucleïnezuur, ons genetisch materiaal), dat wil zeggen, ze zijn niet-specifiek.

Daarentegen is er een andere groep van endonucleasen die heel specifiek zijn in de regio of volgorde die ze gaan accijnzen. Deze groep enzymen staat bekend als restrictie-enzymen en ze zijn zeer bruikbaar in de moleculaire biologie. In deze groep hebben we de bekende enzymen Bam HI, Eco RI en Alu I.

In tegenstelling tot endonucleasen is er een ander type katalytische eiwitten - de exonucleasen - die verantwoordelijk zijn voor het verbreken van de fosfodiësterkoppeling aan het einde van de keten..

index

  • 1 Restrictie-endonucleasen
  • 2 Functies en toepassingen van restrictie-endonucles
    • 2.1 Restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP)
  • 3 soorten restrictie-endonucleasen
    • 3.1 Type I
    • 3.2 Type II
    • 3.3 Type III
    • 3.4 Type IV
  • 4 Referenties

Restrictie-endonucleasen

Restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen zijn katalytische eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het splitsen van de fosfodiesterbindingen in de DNA-keten in zeer specifieke sequenties.

Deze enzymen kunnen worden verkregen in meerdere biotechnologiebedrijven en hun gebruik is bijna onmisbaar binnen de huidige DNA-manipulatietechnieken.

De restrictie-endonucleasen worden genoemd met behulp van de eerste letters van de binomiale wetenschappelijke naam van het organisme waarvan ze afkomstig zijn, gevolgd door de stam (dit is optioneel) en eindigt met de groep restrictie-enzymen waartoe ze behoren. BamHI en EcoRI zijn bijvoorbeeld algemeen gebruikte endonucleasen.

Het DNA-gebied dat het enzym herkent, wordt de restrictieplaats genoemd en is uniek voor elk endonuclease, hoewel verschillende enzymen op de restrictieplaatsen kunnen samenvallen. Deze site bestaat over het algemeen uit een korte palindrome sequentie van ongeveer 4 tot 6 basenparen lang, zoals AGCT (voor Alu I) en GAATTC voor Eco RI.

Palindrome sequenties zijn sequenties die, hoewel ze in de richting 5 'naar 3' of 3 'naar 5' worden gelezen, identiek zijn. In het geval van Eco RI is de palindrome sequentie bijvoorbeeld: GAATTC en CTTAAG.

Functies en toepassingen van restrictie-endonucles

Gelukkig voor moleculaire biologen hebben bacteriën in de loop van de evolutie een reeks restrictie-endonucleasen ontwikkeld die het genetisch materiaal intern fragmenteren.

In de natuur zijn deze enzymen geëvolueerd - vermoedelijk - als een systeem van bacteriële bescherming tegen de invasie van vreemde DNA-moleculen, zoals die van fagen.

Om onderscheid te kunnen maken tussen het eigen en het vreemde genetische materiaal, kunnen deze restrictie-endonucleasen specifieke nucleotidesequenties herkennen. Het DNA dat deze sequentie niet heeft, kan dus ongestoord in de bacterie aanwezig zijn.

Wanneer de endonuclease daarentegen de restrictieplaats herkent, bindt het zich aan het DNA en snijdt het.

Biologen zijn geïnteresseerd in het bestuderen van het genetisch materiaal van levende wezens. DNA bestaat echter uit verschillende miljoen basenparen lang. Deze moleculen zijn extreem lang en moeten in kleine fragmenten worden geanalyseerd.

Om dit doel te bereiken, zijn restrictie-endonucleasen geïntegreerd in de verschillende protocollen voor moleculaire biologie. Een individueel gen kan bijvoorbeeld worden vastgelegd en gerepliceerd voor toekomstige analyse. Dit proces wordt een gen "gekloond".

Restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP)

Restrictiefragmentlengtepolymorfismen verwijzen naar het patroon van specifieke nucleotidesequenties in het DNA die restrictie-endonucleasen kunnen herkennen en knippen..

Dankzij de specificiteit van de enzymen wordt elk organisme gekenmerkt door een specifiek snijpatroon in het DNA, afkomstig fragment van variabele lengten.

Typen restrictie-endonucleasen

Historisch gezien zijn restrictie-endonucleasen geclassificeerd in drie soorten enzymen, aangeduid met Romeinse cijfers. De laatste tijd is een vierde type endonuclease beschreven.

Type I

Het belangrijkste kenmerk van type I-endonucleasen is dat het eiwitten zijn die worden gevormd door verschillende subeenheden. Elk van deze functies functioneert als een enkelvoudig eiwitcomplex en heeft gewoonlijk twee subeenheden die R, twee M en één S worden genoemd.

Het S-gedeelte is verantwoordelijk voor de herkenning van de restrictieplaats in het DNA. De R-subeenheid is anderzijds essentieel voor splitsing en de M is verantwoordelijk voor het katalyseren van de methyleringsreactie..

Er zijn vier subcategorieën van type I-enzymen, bekend onder de letters A, B, C en D, die algemeen worden gebruikt. Deze classificatie is gebaseerd op genetische aanvulling.

Type I-enzymen waren de eerste restrictie-endonucleasen die moesten worden ontdekt en gezuiverd. De meest bruikbare in de moleculaire biologie zijn echter die van type II die in de volgende sectie zullen worden beschreven.

Type II

Type II restrictie-endonucleasen herkennen specifieke DNA-sequenties en voeren splitsing uit op een constante positie nabij een sequentie die 5'-fosfaten en 3'-hydroxylen produceert. Magnesiumionen zijn meestal nodig als co-factoren (mg2+), maar er zijn een aantal met veel meer specifieke vereisten.

Structureel kunnen ze verschijnen als monomeren, dimeren of zelfs tetrameren. Recombinante technologie gebruikt type II endonucleasen en om deze reden zijn meer dan 3500 enzymen gekarakteriseerd.

Type III

Deze enzymsystemen zijn samengesteld uit twee genen, genaamd modern en rundvlees, welke code voor subeenheden die DNA herkennen en voor wijzigingen of beperkingen. Beide subeenheden zijn nodig voor de beperking, een proces dat volledig afhankelijk is van de hydrolyse van de ATP.

Om het DNA-molecuul te splitsen, moet het enzym een ​​interactie aangaan met twee kopieën van de niet-palindrome herkenningssequentie en moeten de plaatsen zich in een omgekeerde oriëntatie op het substraat bevinden. De splitsing wordt voorafgegaan door een translocatie van het DNA.

Type IV

Er is de laatste tijd een extra groep geïdentificeerd. Het systeem is samengesteld uit twee of meer genen die coderen voor eiwitten die alleen gemodificeerde DNA-sequenties splitsen, hetzij gemethyleerde, gehydroxymethyleerde of gehydrosyleerde glycosyl.

Het enzym EckKMcrBC herkent bijvoorbeeld twee dinucleotiden van de algemene vorm RmC; een purine gevolgd door een gemethyleerd cytosine, dat kan worden gescheiden door verschillende basenparen - van 40 tot bijna 3000. De splitsing vindt plaats ongeveer 30 basenparen na de plaats die het enzym herkent.

referenties

  1. Burrell, M.M. (red.). (1993). Enzymen van de moleculaire biologie. Totowa, NJ: Humana Press.
  2. Loenen, W.A., Dryden, D.T., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Type I restrictie-enzymen en hun verwanten. Nucleic acids research, 42(1), 20-44.
  3. Murray, P.R., Rosenthal, K.S., & Pfaller, M.A. (2017). Medische microbiologie + StudentConsult in Spaans + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
  4. Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restrictie-endonucleasen bij de analyse en herstructurering van DNA-moleculen. Jaaroverzicht van biochemie, 44(1), 273-293.
  5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Type II restrictie-endonucleasen: structuur en mechanisme. Cellulaire en moleculaire levenswetenschappen, 62(6), 685.