Gramkleuring foundation, materialen, techniek en toepassingen



de Gram-kleuring is de eenvoudigste en meest bruikbare kleurtechniek in diagnostische microbiologie. Deze techniek is gemaakt door de Deense arts Hans Christian Gram in 1884, die erin slaagde om de bacteriën in Gram-positief en Gram-negatief te classificeren, volgens de samenstelling van de celwand.

De techniek onderging bepaalde wijzigingen door Hucker in 1921 om de reagentia te stabiliseren en de kwaliteit van de vlek te verbeteren, zodat de Gram-kleuring ook bekend staat als Gram-Hucker.

Met deze techniek is het ook mogelijk om de vorm te observeren die micro-organismen hebben, dat wil zeggen of ze cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorf, filamenteus, onder anderen zijn. Evenals de distributie in de ruimte: in cluster, in keten, geïsoleerd, in paren, in tetrads, etc..

Wanneer een bacteriële infectie wordt vermoed, moeten de meeste van de ontvangen monsters op een glasplaatje worden verspreid en worden gekleurd met Gram voor onderzoek onder de microscoop..

Het rapport van de Gram zal de arts begeleiden over welk type micro-organisme de oorzaak van de infectie kan zijn, voordat het uiteindelijke resultaat van het gewas wordt verkregen.

In sommige gevallen is het leven van de patiënt zeer gecompromitteerd, dus artsen hebben dringend behoefte aan het Gram-rapport om een ​​empirische behandeling te plaatsen, in afwachting van de identificatie van het micro-organisme..

Als het Gram bijvoorbeeld onthult dat er Gram-positieve coccen in de hersenvocht zijn, zal de arts de initiële therapie oriënteren met antibiotica die dit type bacteriën elimineren, volgens de protocollen die ervoor zijn vastgesteld..

Zodra het eindresultaat aankomt met de naam van het geïsoleerde micro-organisme en het bijbehorende antibiogram, zal de arts evalueren of de therapie al dan niet moet worden gewijzigd. Deze beslissing zal worden genomen volgens de studie van de gevoeligheid van het micro-organisme voor de antibiotica die het ontvangt en de evolutie van de patiënt..

index

  • 1 Foundation
  • 2 materialen
  • 3 Voorbereiding van kleurstoffen en reagentia
    • 3.1 Kristalviolet oplossing
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 Bleken
    • 3.4 Contrast
  • 4 Opslag van reagentia
  • 5 Voorbereiding van de verspreiding van het te kleuren monster
    • 5.1 -gram van directe monsters
    • 5.2 -Gam van gewassen
  • 6 Techniek
  • 7 Utility
  • 8 Veelgemaakte fouten
  • 9 Referenties

stichting

Dit is een techniek die 4 fundamentele stappen presenteert: kleuring, fixatie met het bijtmiddel, verkleuring en contrinatie. Daarom differentieert deze techniek, naast het inkleuren van de bacteriën, ook.

Het kristalviolet kleurstof wordt eerst gebruikt. Het heeft een affiniteit voor peptidoglycaan en vlek paarse alle bacteriën dan lugol, als beitsmiddel, dat wordt geplaatst, zal de vorming van onoplosbare complexen kristalviolet-jood induceert - ribonucleaire eiwitten in de cel.

Gram-positieve bacteriën, met een dikke wand van peptidoglycaan, vormen meer complexen (kristalviolet-jodium), daarom behouden ze de kleurstof.

Het beïnvloedt ook dat de Gram-positieve bacteriemuur een grotere hoeveelheid onverzadigde zuren bevat, die een hoge affiniteit voor oxidatiemiddelen vertonen (Lugol).

Ondertussen hebben Gram-negatieve bacteriën een dunne laag peptidoglycan, waardoor bacteriën minder complex zijn dan Gram-positieve bacteriën.

Dan komt de stap van verkleuring, waarbij Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën zich anders gedragen.

Gram-negatieve bacteriën bevatten een buitenmembraan dat rijk is aan lipopolysacchariden en dat deel uitmaakt van de celwand. Vetten worden vernietigd door contact met alcoholaceton, zodat het buitenmembraan wordt gedestabiliseerd en het violette kristal wordt vrijgegeven.

Dit is hoe het vervolgens wordt tegengekleurd met safranin of basale fuchsine, waarbij de kleur rood wordt.

In het geval van Gram-positieve bacteriën zijn ze bestand tegen verkleuring, omdat het bleekwater de poriën afsluit, waardoor het kristalviolet / jodiumcomplex niet kan ontsnappen.

Daarom is de verkleuring met het violette kristal stabiel en is er geen ruimte voor safranin of fuchsine. Hierdoor kleuren deze bacteriën intens blauw of paars.

materialen

De Gram-kleurset bestaat uit:

  • Violet kristal
  • Lugol
  • Aceton alcohol
  • Safranin of basale fuchsine

Bereiding van kleurstoffen en reagentia

Kristalviolet oplossing

Oplossing A:

Violet kristal -2 gr

Ethylalcohol 95% -20cc

Oplossing B:

Ammoniumoxalaat -0,8 gr

Gedistilleerd water - 80 cc

Voor de uiteindelijke bereiding van het violette kristal moet de 1:10-oplossing worden verdund met gedestilleerd water en worden gemengd met 4 delen van oplossing B. Het mengsel wordt 24 uur vóór gebruik bewaard. Het wordt gefilterd in een fles voor barnsteenkleuring met behulp van een papieren filter.

Het bedrag dat dagelijks wordt gebruikt, wordt overgebracht naar een amberkleurige fles met druppelaar.

Jood-Lugol

Weeg en meet de aangegeven hoeveelheid van elke verbinding, als volgt:

Crystals of Iodo - 1gr

Kaliumjodide - 2gr

Gedistilleerd water - 300 cc

Het kaliumjodide lost beetje bij beetje in het water op en vervolgens wordt het jodium toegevoegd. De oplossing is geschoren tot een amberkleurige fles.

De hoeveelheid die dagelijks wordt gebruikt, wordt overgebracht naar een kleinere barnsteenfles met druppelaar.

bleken

95% ethylalcohol -50 ml

Aceton - 50 ml

Het is in gelijke delen voorbereid. Bedek goed, het heeft de neiging te verdampen.

Plaats in een fles met druppelaar.

Deze voorbereiding geeft een verkleuring in gematigde tijd van 5-10 sec en is de meest aanbevolen.

Beginners geven er de voorkeur aan om alleen 95% ethylalcohol te gebruiken, waarbij de verkleuring van 10 tot 30 seconden langzamer is.

Terwijl de meest ervaren persoon pure aceton kan gebruiken, waar verkleuring zeer snel optreedt van 1 tot 5 sec.

contrast

Safranin-voorraadoplossing

Safranina -2,5 gr

Ethylalcohol 95% -100 cc

Na het wegen lost de aangegeven hoeveelheid safranine op in 100 cc ethylalcohol tot 95%.

De werkende safranin-oplossing wordt bereid uit de voorraadoplossing.

Meet hiervoor 10 cc van de stamoplossing, voeg 90 cc gedestilleerd water toe om 100 ml te completeren.

Het wordt aanbevolen om het bedrag dat dagelijks wordt gebruikt over te zetten naar een amberkleurige fles met een druppelaar.

Micro-organismen die zwak Gram-negatief kleuren met Gram-Hucker-kleuring, zoals bepaalde anaëroben, Legionella sp, Campylobacter sp en Brucella sp, ze kunnen veel beter worden gekleurd als de door Kopeloff gemaakte modificatie naar Gram-Hucker-kleuring, Gram-Kopeloff-kleuring, wordt gebruikt.

Deze techniek verandert de safranin-kleurstof door basisch fuchsine. Met deze modificatie is het mogelijk om de hiervoor genoemde micro-organismen effectief te kleuren.

Opslag van reagentia

Bereide verfstoffen moeten worden bewaard bij kamertemperatuur.

Voorbereiding van de monsterverspreiding naar kleur

Een monster moet ten minste 10 bevatten5 micro-organismen voordat de waarneming van het micro-organisme in een uitstrijkje waarschijnlijk is. Smeersels kunnen worden gemaakt van het directe monster of kweken in vaste of vloeibare media.

Spreads moeten uniform zijn, goed verdeeld en niet te dik, voor een betere visualisatie van de aanwezige structuren.

-Gram van directe monsters

Urine gram zonder centrifuge

Urine wordt gemengd en 10 μl wordt op een glaasje geplaatst. De waarneming van ten minste één bacterie / onderdompelingsveld geeft aan dat er een infectie is.

Dit betekent dat de kweek ongeveer meer dan 100.000 CFU / ml (105 CFU / ml) van urine in 85% van de gevallen.

Deze methode is niet nuttig voor kolonietellingen onder de 100.000 CFU.

LCR Gram

De CSF moet worden gecentrifugeerd, het supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt op een glaasje uitgespreid. Deze vloeistof is steriel onder normale omstandigheden; de waarneming van bacteriën duidt op infectie.

Gram ademhalingsmonsters

Het sputum Gram, bronchiale of bronchoalveolaire lavage, hoewel er een verscheidenheid aan micro-organismen kan zijn, zal altijd als leidraad dienen bij de diagnose, naast dat het van nut is het type waargenomen cellen.

In het geval van sputum, moet het uitstrijkje worden bereid met de meest etterende porties van het monster.

Kruk Gram

Het is niet aan te raden Gram op dit type monsters uit te voeren, omdat het geen diagnostische waarde heeft.

-Gram gewassen

Ze kunnen op twee manieren worden gedaan, een uit vloeibare gewassen en een andere uit vaste gewassen.

Vloeibare gewassen

Van vloeibare culturen is het uiterst eenvoudig; onder de aansteker worden verschillende braadstukken van de troebele bouillon genomen en ze worden op een schone en droge glijbaan gelegd, waarbij cirkelvormige bewegingen vanuit het midden naar de rand worden geleid, om het materiaal gelijkmatig te verdelen.

Het is toegestaan ​​om spontaan in de lucht te drogen. Als het materiaal eenmaal droog is, wordt het met warmte aan het vel bevestigd. Hiervoor wordt het vel 3 met behulp van een klem 4 keer door de vlam van de bunsenbrander gevoerd, waarbij erop wordt gelet dat het materiaal niet verbrandt.

Het vel wordt toegestaan ​​af te koelen en op de kleurende brug te plaatsen.

Degelijke gewassen

Ga als volgt te werk om een ​​uitbreiding voor Gram-kleuring uit een vaste kweek uit te voeren:

Voordat de koloniën worden gekozen die moeten worden ingenomen, moet de glaasje worden voorbereid, waarbij twee druppels van ongeveer een steriele fysiologische zoutoplossing worden geplaatst.

Als de originele kweekplaat verschillende soorten kolonies bevat, zal een geïsoleerde kolonie van elk worden gekozen om het Gram uit te voeren. Elke kolonie wordt met de platinalus genomen om het in de zoutoplossing op te lossen die eerder op de dia was geplaatst.

Circulaire bewegingen worden gegeven van het centrum naar de periferie, om de kolonie homogeen op de dia te verdelen..

Het is toegestaan ​​om spontaan in de lucht te drogen. Eenmaal droog wordt het vel vastgezet met warmte, zoals hierboven uitgelegd (vlammend op de schuif met de aansteker), en zorg ervoor dat het materiaal niet verbrandt.

Deze procedure moet met elke verschillende kolonie worden uitgevoerd. Op een stuk papier moet de volgorde van de waargenomen punten worden vermeld, bijvoorbeeld:

Kolonie 1: Gele beta-hemolytische kolonie: gram-positieve kokken werden waargenomen in clusters

Kolonie 2: Roomkolonie, zonder hemolyse: Gramnegatieve coccobacilli werden waargenomen.

Elk blad moet worden gelabeld om te weten wat we waarnemen.

techniek

Gramkleuringstechniek is buitengewoon eenvoudig uit te voeren en relatief goedkoop en kan niet worden gemist in een microbiologisch laboratorium.

Hetzelfde gebeurt als volgt:

  1. Bevestig het uitstrijkje met warmte en plaats het op de gekleurde brug.
  2. Het vel wordt gedurende 1 minuut volledig bedekt met violet glas.
  3. Was met water. Niet drogen
  4. Bedek de plaat met Lugol-oplossing, laat gedurende 1 minuut staan. Was met water. Niet drogen.
  5. Meng gedurende 5-10 seconden met zacht schudden in acetonalcohol. Of plaats het vel rechtop en laat druppeltjes van het ontkleurende middel op het oppervlak vallen totdat het resterende violette glas is weggesleept. Niet overschrijden.
  6. Was met water. Niet drogen.
  7. Vervang het vel op de gekleurde brug en dek het gedurende 30 sec af met safranin (Gram-Hucker) of 1 min met basis fuchsin (Gram-Kopeloff).
  8. Was met water
  9. Laat spontaan drogen in verticale lucht.

Breng na het drogen 1 druppel onderdompelingsolie aan om deze onder het objectief van 100X in de optische microscoop te observeren.

utility

Met deze techniek kunnen de morfotypische verschillen van de meeste bacteriën worden onderscheiden.

Gisten onderscheiden zich ook door deze kleur. Ze nemen het kristalviolet, dat wil zeggen dat ze grampositief kleuren.

Aan de andere kant kunnen Gram-positieve sporenvormende bacillen worden onderscheiden, waarbij een duidelijke ruimte wordt waargenomen in de bacillus, waar de endospore werd gevormd, hoewel de sporen niet goed kleuren. Om sporen te gebruiken, worden andere technieken zoals Shaeffer-Fulton gebruikt.

Opgemerkt moet worden dat deze vlek niet dient om alle soorten bacteriën te kleuren, dat wil zeggen, er zijn gevallen waarin de kleuring niet werkt.

In dit geval kunnen bacteriën worden genoemd die een celwand missen. Bijvoorbeeld: genus Mycoplasma, sferoplasten, Ureaplasma, L-vormen en protoplasten.

Het bevlekt ook slecht bacteriën met muren die rijk zijn aan mycolzuren, zoals Mycobacteriën en intracellulaire bacteriën zoals Chlamydias en Rickettsias.

Het is ook inefficiënt om de meeste spirocheten te bevlekken.

Er zijn bacteriën van hetzelfde geslacht die kunnen worden waargenomen in hetzelfde monster als Gram-positief en als Gram-negatief. Wanneer dit gebeurt, wordt dit variabele Gram-kleuring genoemd, wat kan komen door verandering in voedingsstoffen, temperatuur, pH of concentratie van elektrolyten..

Veelgemaakte fouten

Overmatig bleken

Overdrijven in de verkleuringsstap kan de waarneming van valse gramnegatieve micro-organismen veroorzaken.

Wacht niet lang genoeg om de onderdompelingsolie toe te voegen:

Deze fout veroorzaakt de vorming van vette micellen die het moeilijk maken om de aanwezige structuren te observeren. Dit gebeurt wanneer de olie de watermoleculen in het uitstrijkje verbindt.

Keer de volgorde van de reagentia om:

Een dergelijke fout zorgt ervoor dat gramnegatieve bacteriën paars worden weergegeven, dat wil zeggen, onjuist grampositief.

Gebruik oude gewassen (vast of vloeibaar):

Het kan ervoor zorgen dat Gram-positieve bacteriën Gram-negatief kleuren (vals Gram-negatief). Dit gebeurt omdat het in de oude culturen waarschijnlijk is dat er dode of verslechterde bacteriën zijn en dat onder deze omstandigheden de bacteriën het violette kristal niet behouden.

Gebruik de zeer oude Lugol-oplossing:

Na verloop van tijd verliest het lugol zijn eigenschappen en vervaagt de kleur. Als het reeds gedegenereerde reagens wordt gebruikt, zal het kristalviolette putje niet worden gefixeerd, daarom is er de mogelijkheid om een ​​visualisatie van micro-organismen vals Gram-negatief te verkrijgen.

Blauwachtige achtergrond

Een goed verkleurde achtergrond is rood. Een blauwe achtergrond geeft aan dat de verkleuring onvoldoende was.

referenties

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. microbiologie Medical, 6e editie McGraw-Hill, New York, V.S.
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. (5de ed.). Argentinië, redactie Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Microbiologische diagnose van Bailey & Scott. 12 ed. Argentinië. Panamericana S.A Editorial
  4. Casas-Rincón G. 1994. General Mycology. 2e editie Universidad Central de Venezuela, Bibliotheekedities. Venezuela, Caracas.
  5. "Gramkleuring" Wikipedia, de gratis encyclopedie. 4 oktober 2018, 23:40 uur UTC. 9 dec 2018, 17:11. Genomen van es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Manual of Medical Microbiology. 2e editie, Venezuela: Directoraat van media en publicaties van de Universiteit van Carabobo.
  7. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C Colin-Castro Pena-Ortega S, G Cerón-González, F. Franco-Cendejas basische kleurstoffen in de microbiologielaboratorium. Onderzoek naar invaliditeit. 2014; 3 (1): 10-18.