Beits door Stichting May Grünwald-Giemsa, techniek en toepassingen



de May Grünwald-Giemsa vlek o Pappenheim is een differentiële kleuringstechniek die de Giemsa en May Grünwald-reagentia mengt. Het wordt gebruikt voor de differentiatie van normale en abnormale bloedcellen in uitstrijkjes van perifeer bloed en beenmerg, alsook voor de kleuring van histologische coupes en cytologische monsters.

Beide reagentia - Gemsa en May Grünwald - zijn afgeleid van Romanowsky-achtige kleuring, een techniek die is gebaseerd op de combinatie van zure en basische kleurstoffen.

Giemsa verbeterde de techniek door het mengsel van eosine, methyleenblauw en zijn derivaten te stabiliseren met glycerol. Daarentegen gebruikt May Grünwald eosine en methyleenblauw, waarbij methanol als oplosmiddel wordt gebruikt. Deze strategische combinatie heeft uitstekende resultaten opgeleverd.

Hoewel de techniek qua celmorfologie op dezelfde manier werkt als de Giemsa en Wright-kleuring, verbetert deze techniek de vorige door de verkleuring van de parasieten die malaria, de ziekte van Chagas, leishmaniasis en trichomoniasis veroorzaken, aan te passen..

Bovendien is het een zeer nuttige techniek gebleken voor de cytologische studie van spermavloeistof. Het is niet alleen benadrukt door de morfologische kenmerken van sperma te tonen, maar maakt het ook mogelijk om te differentiëren met leukocyten, epitheliale cellen en cellen van spermatogenese met grote efficiëntie..

index

  • 1 Foundation
    • 1.1 Verscheidenheid aan kleurstoffen
  • 2 Techniek
    • 2.1 Materialen
    • 2.2 Geconcentreerde kleurstofoplossing May Grünwald
    • 2.3 Geconcentreerde Giemsa-kleurstof
    • 2.4 Bereiding van de bufferoplossing bij pH 7,2
    • 2.5 Bloeduitstrijkjes of beenmergkleuring
    • 2.6 Uitgebreide kleuringstechniek van spermavloeistof
    • 2.7 Belangrijke specificaties
  • 3 Gebruik
    • 3.1 Vaginale cytologie
    • 3.2 Spermastaal
  • 4 Referenties

stichting

De techniek volgt de basis van Romanowsky's vlekken, waarbij de zure kleurstoffen selectieve affiniteit hebben voor de cellulaire basiscomponenten en de zure componenten de basische kleurstoffen aantrekken..

Op een andere manier verklaard, hebben zowel celstructuren als kleurstoffen positieve of negatieve elektrische ladingen; gelijke ladingen worden afgeweerd en verschillende ladingen worden aangetrokken.

Basale kleurstoffen zoals methyleenblauw zijn bijvoorbeeld positief geladen en worden aangetrokken door negatief geladen structuren. Dat is de reden waarom deze kleurstof kernen bevat die rijk zijn aan DNA en RNA met negatief geladen fosfaatgroepen.

De korrels van de gesegmenteerde basofielen en cytoplasma's van de mononucleaire witte bloedcellen die RNA bevatten, zijn ook gekleurd.

Op dezelfde manier draagt ​​de zure kleurstof een negatieve lading, wat de reden is dat het zich verbindt met positief geladen structuren zoals de erythrocyten en de korrels van de gesegmenteerde eosinofielen. Wat betreft de korrels van de gesegmenteerde neutrofielen, fixeren deze beide kleurstoffen.

Verscheidenheid aan kleurstoffen

In deze techniek bestaat een combinatie van reacties tussen orthochromatische kleurstoffen en metachromatica naast elkaar. Orthochromatica (eosine en methyleenblauw) binden aan de celstructuur waarmee ze verwant zijn en zorgen voor een stabiele kleur die niet varieert.

Aan de andere kant variëren metachromatica (de derivaten van methyleenblauw azuur A en azuur B) hun oorspronkelijke kleur zodra ze gebonden zijn aan de specifieke structuur, en er kan zelfs een verscheidenheid aan kleuren zijn.

Tot slot vereist de stap die door de May Grünwald-oplossing wordt uitgevoerd de aanwezigheid van water, omdat zonder dat de kleurstof de structuren zal binnendringen maar niet zal worden gefixeerd. Om dit te laten gebeuren, moet de kleurstof polair of geïoniseerd worden en dus kunnen neerslaan en zich hechten aan verwante structuren.

techniek

materialen

- Dia's voor dia's.

- Kleurende bruggen.

- Oplossing van May-Grünwald.

- Giemsa vlek.

- Gedestilleerd water.

Geconcentreerde kleurstofoplossing May Grünwald

We moeten 0,25 g eosine-methyleenblauw (kleurstof volgens May Grünwald) wegen en oplossen in 100 ml methanol. Het mengsel wordt vervolgens gedurende 1 uur gemengd en gedurende 24 uur met rust gelaten. De tijd is voltooid, het filtert.

Om de techniek toe te passen, moet de May Grünwald-kleurstof als volgt worden verdund: voor 200 ml verdunde kleurstof wordt 30 ml van de geconcentreerde oplossing gemeten, 20 ml bufferoplossing en 150 ml gedestilleerd water, aangepast aan pH7,2-7,3, worden toegevoegd. . Het wordt dan gemengd en gefilterd.

Geconcentreerde Giemsa-kleurstof

Weeg 0,5 g azur-eosine-methyleenblauw (kleurstof volgens Giemsa), los op in 50 ml methanol en plaats 50 ml glycerol in het mengsel.

Om de techniek uit te voeren, 1:10 verdunnen met bufferoplossing en 10 minuten laten rusten. Het kan zo nodig worden gefilterd.

Bereiding van de bufferoplossing bij pH 7,2

Ze moeten worden gewogen:

- 40 mg kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4).

- 151 mg di-natriumwaterstoffosfaat 12-hydraat (Na2HPO4).

Beide verbindingen worden opgelost in 100 ml water.

Bloeduitstrijkje of beenmergkleuring

Er zijn twee modaliteiten: een klassieke en een snelle.

Klassieke modus

  1. Bedek de uitstrijkjes gedurende 2 of 3 minuten met een verdunde May-Grünwald-oplossing.
  2. Was met gebufferd gedestilleerd water om de vorige oplossing te verwijderen.
  3. Bedek met dezelfde gebufferde wasoplossing en laat gedurende 1 minuut staan. Het idee is dat de vorige kleurstof aan de structuren is bevestigd en dat tegelijkertijd de cellen worden gehydrateerd.
  4. Voeg 12 druppels verdunde Giemsa-tinctuur toe aan het gebufferde water en blaas om te mengen en homogeniseren. Laat 15 of 20 minuten staan.
  5. Was de uitstrijkjes met gebufferd gedestilleerd water en laat het drogen.
  6. Focus en observeer in een optische microscoop de bloedcellen gekleurd met het 40X-objectief. Indien nodig kan de 100X worden gebruikt.

Snelle modus

  1. Bedek het uitstrijkje met May Grünwald kleurstof verdund gedurende 1 minuut.
  2. Was met gebufferd gedestilleerd water.
  3. Dek af met gebufferd water en laat 1 minuut staan.
  4. Plaats de verdunde Giemsa-kleurstof en laat 5 minuten staan.
  5. Was met gebufferd gedistilleerd water en laat aan de lucht drogen.

De technieken die hier worden beschreven, zijn een leidraad, maar er moet rekening mee worden gehouden dat de procedures en kleurtijden variëren afhankelijk van het commerciële huis dat de reagentia levert. Het is raadzaam om de stappen strikt aangegeven door elke commerciële huis te volgen.

Sperma vloeistof uitgebreide kleuringstechniek

1- Bedek de spread gedurende 4 minuten met een dunne laag May Grünwald-oplossing.

2- Verwijder de kleurstof en was met gedestilleerd water.

3- Plaats een laag verdunde Giemsa (1:10) gedurende 15 minuten in gedestilleerd water.

4- Verwijder de kleurstof en was met gedestilleerd water.

5- Laten drogen en onder de microscoop observeren.

Belangrijke specificaties

De techniek vereist dat de reagentia en wasoplossingen een pH hebben ingesteld op 7,2 - 7,3, zodat de affiniteiten van de kleurstoffen voor de celstructuren niet de uiteindelijke verwachte kleur vervormen en niet variëren.

toepassingen

Deze techniek wordt door klinische laboratoria gebruikt voor het kleuren van uitstrijkjes van perifeer bloed en beenmerg, weefselsecties en cytologieën.

In het hematologische veld is deze techniek van vitaal belang bij de studie van abnormaliteiten van cellen in termen van vorm, grootte en aantal. Het is een zeer waardevol hulpmiddel voor de diagnose van bepaalde ziekten, zoals leukemie en bloedarmoede.

Bovendien biedt het een uitstekende bruikbaarheid bij het zoeken naar parasieten in de hematologische velden (Plasmodium sp en Trypanosoma cruzi) of histologisch (Leishmanias sp).

Vaginale cytologie

Wat betreft vaginale cytologie, deze techniek is vooral gunstig voor de waarneming van Trichomonas vaginalis. Dit is een belangrijke bevinding, aangezien de aanwezigheid ervan carcinoma's simuleert in situ die dan verdwijnen wanneer de parasiet wordt geëlimineerd.

Zaad monster

Het was een ideaal hulpmiddel voor de studie van spermastalen, omdat het waardevolle informatie biedt over de kwaliteit van sperma.

De gegevens die het biedt hebben voornamelijk te maken met aantal en morfologie, evenals met de bijkomende cellen die aanwezig kunnen zijn en die van vitaal belang zijn, zoals kiemcellen, leukocyten en epitheelcellen.

Met deze analyse is het mogelijk om afwijkingen te beschrijven die zijn waargenomen in het sperma in het hoofd, de nek, het middenstuk en het hoofdstuk.

Daarnaast kunnen ze ook helpen om gevallen van hemospermie (aanwezigheid van rode bloedcellen in het sperma) en leucospermia of pyospermie (toename van het aantal leukocyten in het sperma) te laten zien..

referenties

  1. Costamagna S, Prado M. Validatie van de verse test, May Grünwald-Giemsa en Gram-kleuren en cultuurmedia voor de diagnose van Trichomonas vaginalis. Parasitol. 2001; 25 (1-2): 60-64. Beschikbaar in: scielo.
  2. Merck KGaA-laboratorium. May Grünwald eosine methyleenblauw voor microscopie.
  3. "May-Grünwald-Giemsa vlek." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 15 november 2018, 14:37 uur UTC. 8 januari 2019, 04:29: en.wikipedia.org
  4. Laboratory Glass Chemicals Panreac. Reagentia voor histologische technieken, hematologie en microbiologie. Beschikbaar bij: glasschemicals.com
  5. Retamales E, Manzo V. Aanbeveling voor het kleuren van bloedvlekken voor het lezen van de bloedtelling. Nationaal en referentie biomedisch laboratorium. Institute of Public Health of Chile.
  6. Sarabia L. Spermiogram volgens de WHO-criteria. Programma van Anatomie en Biologie van ontwikkeling. Faculteit Geneeskunde Universiteit van Chili Beschikbaar op: pp.centramerica.com