Wright's vlekbasis, materialen, techniek en toepassingen



de Wrigth's vlek is een kleuringstechniek gemaakt door de Amerikaanse patholoog James Homer Wright in 1902, uit de smet van Romanowsky. Omdat de kleuring van Romanowsky onstabiel was, nam Wrigth methanol op als oplosmiddel en fixeermiddel.

Deze kleuring is polychromatisch, wat betekent dat het verschillende kleuren genereert, afhankelijk van de structuur die de kleurstof opneemt. Deze kleuringstechniek is op grote schaal toegepast om verschillende aantallen witte bloedcellen uit te voeren en de morfologie van rode bloedcellen, bloedplaatjes en leukocyten in perifeer bloed en beenmerg te bestuderen..

De toepassing ervan is erg belangrijk, omdat afwijkingen in de verschillende cellijnen van het bloed kunnen worden waargenomen, wat de diagnose van ziekten zoals leukemie of bacteriële of parasitaire infecties vergemakkelijkt..

Misschien zijn dit de meest voorkomende toepassingen waarin deze techniek wordt gebruikt, maar ze zijn niet de enige. Het is ook nuttig in andere monsters dan bloed en beenmerg, zoals monsters van nasale afscheiding, fecaal slijm, sputum, huid, onder anderen..

index

  • 1 Foundation of Wright's smet
  • 2 materialen
    • 2.1 Voorbereiding
    • 2.2 Gebufferde bufferoplossing
    • 2.3 Extra materialen die nodig zijn om de kleuring uit te voeren
  • 3 componenten van Wright's vlek
    • 3.1 Methanol
    • 3.2 De schokdemper
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Methyleenblauw
  • 4 Techniek
  • 5 Utility
    • 5.1 Hematologie
    • 5.2 Nasale secretie
    • 5.3 Parasitologie
    • 5.4 Luchtweginfecties
    • 5.5 Bacteriologie
    • 5.6 Mycologie
  • 6 Hoe worden de structuren van het bloedmonster waargenomen met de vlek van Wright??
  • 7 Aanbevelingen voor een goede kleuring
  • 8 Veelgemaakte fouten in Wrigth-kleuren
    • 8.1 Zeer bleke kleuring
    • 8.2 Neerslag van de kleurstof
    • 8.3 Uitstrijkje met extreem roodachtige of blauwe kleur
  • 9 Opslagmodus
  • 10 referenties

Wright's vlek foundation

De vlek van Wright werd geboren uit de vlek van Romanowsky, die bestaat uit een oplossing van methylalcohol van een zure kleurstof (eosine Y) en een basische (methyleenblauw) en zijn oxidatieproducten.

Het mengsel van kleurstoffen dat wordt gebruikt in de vlek van Wright veroorzaakt het effect dat bekend staat als Romanowsky, dat wil zeggen, het verschaft een prachtige paarse kleuring aan de kernen van de leukocyten en aan de neutrofiele granules, terwijl de rode bloedcellen roze worden geverfd..

De componenten die verantwoordelijk zijn voor het geven van het kleurbereik dat typerend is voor Wright's kleuring zijn blauw B en eosine Y. Het waargenomen effect zal afhangen van de binding van de kleurstoffen aan de chemische structuren en de interacties van blauw B en eosine Y.

Zure structuren zoals nucleïnezuren, nucleaire eiwitten en reactief onvolgroeid cytoplasma van sommige celtypen, fixeren blauw B (basische kleurstof).

Terwijl de basisstructuren zoals hemoglobine, de korrels van de gesegmenteerde eosinofielen, naast andere celstructuren, de eosine Y (zure kleurstof) fixeren.

Het resultaat van de kleuring kan worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals de pH van de Wright-kleurstof, de buffer en de wasoplossing; evenals de vlek- en fixeertijd.

Daarom is elke stap in de voorbereiding van de reagentia cruciaal en moet er voor elk detail worden gezorgd.

materialen

Wright kleuring. Voor 100 ml is het vereist:

Weeg 0,3 g Wright-kleurstof af, meet 97 ml methanol en 3 ml glycerol.

voorbereiding

Plaats in een mortier de zware hoeveelheid Wright's kleurstof en voeg langzaam de glycerol toe tot het poeder volledig is opgelost..

Vervolgens wordt de methanol toegevoegd, gemengd en in een amberkleurige fles gegoten.

Voor gebruik dient de oplossing te worden geschud met zachte bewegingen en filter.

Buffered buffer

In een liter gedestilleerd water werd 3,76 g dinatriumhydrofosfaat (Na2HPO4   2H20) plus 2,1 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH)2PO4).

Meng goed totdat alle opgenomen reagentia zijn opgelost. Stel de pH in op 7,2. Giet in een glazen pot en bewaar op kamertemperatuur.

Extra materialen die nodig zijn om de kleuring uit te voeren

Daarnaast zijn andere materialen nodig om de kleurtechniek uit te voeren, dit zijn: vellen die voorwerpen dragen of voorwerpen bedekken, een brug van kleuring, pisetas met water of buffer om te wassen, een stopwatch om de kleurtijden en wat droogmateriaal aan te nemen (absorberend papier, gaas of katoen).

Wright-vlekcomponenten

methanol

Alcohol (methanol) dient als fixeermiddel voor de bloeduitstorting op de glaasje.

In principe is het een reagerend middel voor het verminderen van reagentia, dehydratatie en coagulant. Daarom is het zijn functie om de eiwitten te coaguleren en ze onoplosbaar te maken, maar zonder ze te denatureren.

Methanol is het meest gebruikte reagens om uitstrijkjes in alle laboratoria te fixeren, omdat het betere resultaten geeft dan die verkregen met ethanol. De ideale concentratie is 99%.

De schokdemper

De buffer (gebufferde oplossing) heeft de functie van het instellen of handhaven van de pH van de kleurstof, aangezien een pH die is aangepast tot 7,2 essentieel is voor celstructuren om kleurstoffen op de juiste wijze te absorberen.

Aan de andere kant, de passage van methanol fixatie dehydrateert de cellen en de buffer helpt hen rehydrateren.

Eosin (Y)

Eosine heeft een affiniteit voor basiscomponenten omdat het een zure kleurstof is. Twee soorten eosine lijken sterk op elkaar, dus een van de twee kan worden gebruikt, zodat hetzelfde resultaat wordt behaald.

De ene wordt eosine Y, gele eosine of tetrabroomfluoresceïne en de andere eosine B, blauwachtige erythrosine B of dibromodinitrofluoresceïne genoemd. Eosine Y wordt echter het meest gebruikt.

De belangrijkste eigenschap van deze kleurstof is de negatieve polariteit, waardoor deze wordt aangetrokken door cellulaire structuren met positieve lading.

Methyleenblauw

Het is de basiskleuring. Zijn belangrijkste eigenschap is metachromasie, dat wil zeggen dat niet alle structuren dezelfde kleur zullen worden geverfd, het hangt af van de chemische samenstelling van de structuren dat deze kleurt.

Sommige zullen licht of donkerblauw worden en andere donkerpaars of licht lila.

techniek

1-Voer de verspreiding van het monster uit zodat er een dunne film overblijft, hetzij op een glaasje of dekglaasje.

2-Laat ongeveer 2 uur aan de lucht drogen.

3-Plaats het droge uitstrijkje op de vlekbrug of kleuringsbak met het monster naar boven verdeeld.

4 - Bedek het vel met de Wright-verf druppel voor druppel tot het het hele oppervlak bedekt. Laat het 5 - 8 minuten aan.

5-De kleurstof moet de schuif volledig bedekken, zonder over de randen te morsen. Als het tijdens de kleurperiode begint te verdampen, moeten er extra druppels worden geplaatst.

6-Vervolgens voeg een gelijke hoeveelheid van de schokdemper toe, blaas een beetje totdat de karakteristieke metaalachtige glans verschijnt. Neem 10 tot 15 minuten.

7-Was met kraanwater en plaats de zachte straal totdat het vel roze lijkt.

8 - Verwijder met een gaas geïmpregneerd met alcohol de kleurstof die aan de achterkant van de glaas is bevestigd.

9-Laat het uitstrijkje goed drogen voordat u de immersieolie aanbrengt om het in de microscoop te visualiseren.

utility

hematologie

Het is ideaal voor het smeren van perifere bloeduitstrijkjes, voor het onderzoeken van dikke bloeduitstrijkjes en voor het bestuderen van cellen uit beenmergmonsters.

Vanwege de chemische eigenschappen van deze combinatie van kleurstoffen kunnen de cellulaire structuren gemakkelijk worden herkend, zodat ze de verschillende typen cellen kunnen onderscheiden die aanwezig zijn.

Nasale secretie

Deze techniek is zeer nuttig om de cellen van de nasale secretie (epitheelcellen, gesegmenteerde eosinofielen, polymorfonucleaire cellen) te identificeren bij de diagnose van allergische rhinitis.

parasitologie

In die zin was het nuttig geweest voor de studie van Leishmania sp in de histiocyten van het subcutane cellulaire weefsel in huidzweren. Evenzo wordt het gebruikt voor het identificeren van leukocyten in ontlastingsmonsters (faecaal leucogram).

In dit geval is het van belang voor de arts om te weten of de in de feces aanwezige leukocytose polymorfonucleair of mononucleair is. Deze bevinding in het fecaal leucogram zal helpen als het respectievelijk een bacteriële of virale infectie is.

Aan de andere kant zijn de parasieten die in het bloed circuleren te vinden in de erytrocyt of vrij in het plasma. De gezochte parasieten zijn Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii en filarias, en in de diergeneeskunde is het nuttig bij het zoeken naar Theileria equi en Babesia caballi, veroorzakers van baby's, vooral bij paarden.

Wright en Giemsa-kleuring kunnen hemoparasieten onderscheiden van normale cellulaire componenten. Hiervoor kunt u twee soorten spreads gebruiken:

Fijne strekt zich uit

Het bloed wordt uitgespreid als een dunne film op een dia. Gekleurd met Wright's kleuring, wat de kenmerken van de kern en het cytoplasma onthult.

Dikke drop

Deze methodologie wordt gebruikt om de aanwezigheid van parasieten in een grotere hoeveelheid bloed te onderzoeken.

Hiervoor wordt een grote druppel bloed op een dia geplaatst. Als je daar eenmaal bent, moet je defibreren, waarbij je grotere en grotere cirkels vanuit het midden naar buiten maakt, met behulp van de rand van een andere dia.

Ten slotte moeten de erytrocyten met water worden gelyseerd om de parasieten in het dikke uitstrijkje waar te nemen.

Luchtweginfecties

Op ademhalingsniveau is deze techniek ook nuttig, omdat de cellen die aanwezig zijn in sputummonsters, bronchiale of bronchoalveolaire lavage belangrijk zijn om de diagnose vast te stellen.

Evenzo kunnen polymorfonucleaire cellen en mononucleaire cellen hier worden onderscheiden.

bacteriologie

Het gebruik van deze techniek in de bacteriologie is beperkt, omdat het niet goed is voor het kleuren van de bacteriën, daarom worden er voor de kleuring andere gespecialiseerde kleurtechnieken gebruikt.

Het is echter wel gebruikt om te zoeken naar epitheelcellen met inclusielichamen van Chlamydia trachomatis in uitstrijkjes van urethrale of endocervicale mucosa, hoewel moet worden erkend dat dit niet de beste methode is.

Het is ook mogelijk om spiraalvormige bacteriën te observeren tussen de rode bloedcellen als Borrelia burgdorferi bij geïnfecteerde patiënten, evenals morulae of inclusielichamen van Ehrlichia sp in het cytoplasma van lymfocyten, monocyten of neutrofielen in een bloeduitstrijkje.

mycologie

de Histoplasma capsulatum is een pathogene schimmel die vaak wordt gediagnosticeerd door microscopisch waarnemen van verschillende weefselmonsters, gekleurd met Wright's kleuring.

Hoe worden de structuren van het bloedmonster waargenomen met de vlek van Wright?

Aanbevelingen voor een goede kleuring

Uitbreidingen van bloedmonsters moeten spontaan aan de lucht worden gedroogd. De uitstrijkjes moeten zo dun mogelijk zijn om een ​​betere fixatie van de kleurstof te verkrijgen en overcolloraties te voorkomen.

Voor verven van hoge kwaliteit is het raadzaam om de kleuring uit te voeren gedurende de twee uur na de voorbereiding van het uitstrijkje. Aan de andere kant is het ideale monster capillair bloed, zonder anticoagulans.

Als er echter veneus bloed wordt gebruikt, moet het worden gebruikt als EDTA-anticoagulans en niet als heparine, aangezien de laatste celstructuren kan vervormen.

Om te voorkomen dat verslechtering van de bereide kleurstof moet worden opgeslagen op droge plaatsen.

Tijdens het wasproces wordt het gebruik van water aangepast aan een neutrale pH aanbevolen.

Ten slotte is het aan te raden de verfmethoden die in het laboratorium worden gebruikt zo nu en dan te testen.

Dit wordt gedaan door monsters of uitgebreide patronen te verven, als kwaliteitscontrole. Deze stap is belangrijk, omdat dit ervoor zorgt dat de kleuring goed wordt voorbereid en de kleurtijden goed worden gestandaardiseerd.

Als het patroonblad erg gekleurd is, zijn er problemen die moeten worden opgelost.

Veelgemaakte fouten in Wrigth-kleuren

Zeer bleke kleuring

Zeer bleke vlekken, meestal vanwege een zeer korte kleuring of een zeer overdreven wasbeurt. Dit wordt gecorrigeerd door de contacttijd met de kleurstof te verlengen of door de wastijd te verkorten.

Kleurstof slaat neer

De precipitatie kleurstof uitstrijkje kan verschillende oorzaken hebben, maar de meest voorkomende oorzaken zijn: gebruik van kleurstof ongefilterde kleurstof op bruggen ongelijke kleuring met behulp vuile lakens met stof of vet, doe een goede wasbeurt de afwerking vlekken.

Smeer met extreem roodachtige of blauwe kleuring

De buffer is verantwoordelijk voor de pH van de kleurstof. Kleurstoffen met een pH lager dan het aangegeven (zuur) resulteren in zeer rode uitstrijkjes.

Als de pH van de kleurstof boven (alkalisch) is, wordt een extreem blauwachtig uitstrijkje verkregen.

Opslagmodus

Het reagens moet bij kamertemperatuur worden bewaard.

referenties

  1. V. Gutierrez Vergelijkende studie tussen Wright kleuring en Elisa-test voor de diagnose van honden ehrlichiosis in de stad San Pedro Sula, Honduras. 2008. Thesis voor de titel van dierenarts. Universidad de San Carlos de Guatemala.
  2. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C Colin-Castro Pena-Ortega S, G Cerón-González, F. Franco-Cendejas basische kleurstoffen in de microbiologielaboratorium. Onderzoek naar invaliditeit. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wright's vlek." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 18 mei 2018, 12:05 UTC. 8 dec 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frequentie van Babesia spp. in paarden van montería, Córdoba (Colombia). Rev. udcaactual delulg cient.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Microbiologische diagnose van Bailey & Scott. 12 ed. Argentinië. Panamericana S.A Editorial.
  6. Retamales E, Mazo V. Public Health Institute Government of Chile. Aanbevelingen voor het kleuren van bloedvlekken voor het lezen van de bloedtelling.